HIBRIDACIÓN SOMÁTICA DE PROTOPLASTOS
Es una técnica que puede permitir que diferentes especies de la misma familia sean cruzada, representa una opción para transferir características que seencuentran en las especies silvestres hacia las especies cultivadas, la fusión de protoplastos facilita el flujo genético entre las especies que permite superar las barreras para la hibridación sexualinterespecífica. De igual forma, esto es usualmente imposible siguiendo el proceso normal de regeneración sexual de las plantas. Estableciendo cultivos de protoplastos de cada especie, los cultivos puedenser mezclados y algunos protoplastos de cada especie se fusionarán al azar. Por una cuidadosa selección y cultivo, se podrán regenerar plántulas desde estos protoplastos híbridos y ser ensayados porcaracterísticas deseables in vivo.
AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS
Selección del material de partida.
Tratamiento enzimático: Temperatura 25-30 º C, pH 4,7- 6.
Medio con: Enzimas que degradan lapared celular Celulasas, pectinasas y hemicelulasas
Inhibidores de proteasas: PVP
Estabilizador osmótico: Sorbitol o manitol
Estabilización de membranas: Cl2Ca
Limpieza y purificación de losprotoplastos
MECANISMO DE FUSIÓN
Métodos químicos
Utilizan como fusógeno el polietilenglicol (PGE), alta concentración de Ca2+ (10-50 mm) y Ph elevado (9-11)
Métodos eléctricosAplicación de corriente alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz). Formación de cadenas de protoplastos paralelas a las líneas del campo aplicado.
Aplicación de uno o más pulsos (15 – 100 µsegundos),con intensidad de campo elevada (1-3 Kv/cm). Fusión de los protoplastos.
La frecuencia de fusión depende:
Genotipo
Procedencia de los protoplastos
Tamaño protoplastos
Densidad protoplastosen el medio
Número, duración y fuerza de los pulsos
Potencial osmótico
Longitud de las cadenas
SELECCIÓN DE HETEROCARIONETES
Caracteres morfofisiológicos
Selección por complementación...
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