Hipersensibilidad

Inmunología III
Inmunoensayos. Clasificación

Definición
» Método analítico basado en la reacción antígenoantígeno- anticuerpo » Hay muchos formatos , buscando diferentes características de funcionamiento.

¿Qué es un inmunoensayo?
• Puede ser cualitativo (identificación), semicuantitativo o cuantitativo. • Encuentran aplicación en muchos campos, no sólo en el área clínica: ambiental,alimentaria, agronómica, etc.

Antígenos

• Sustancias que pueden ser reconocida por reacción con ella de anticuerpos. • Estructuras químicas muy diferentes: proteínas, lípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, etc. • Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopos.

Antígenos
• Nativos. • Se obtienen directamente a partir del patógeno. Ej. una proteína purificada• Recombinantes • Péptidos sintéticos

Anticuerpos policlonales
• La inmunización de animales inyectando antígeno • por la vía adecuada, • en dosis adecuadas y • en el adyuvante adecuado, (inmunógeno)

• producción de anticuerpos con diferentes afinidades y con especificidad por diferentes determinantes antigénicos (anticuerpos policlonales).

Anticuerpos policlonales

Conejo, cabra,oveja, etc. Purificación de anticuerpos Separar el suero

Anticuerpos monoclonales
• Se obtienen inmortalizando plasmocitos por fusión con células de mieloma de ratón. • Las células fusionadas (hibridomas) producirán inmunoglobulinas idénticas a las que producía el plasmocito. • Por dilución límite se puede aislar(clonar) cada hibridoma, mantenerlo y expandirlo en cultivo.

Anticuerposmonoclonales

Plasmocitos murinos

Fusión

Células de mieloma

hibridomas

Anticuerpos monoclonales

Cultivo de células individuales en pequeño volumen Producción de Ac Crecimiento continuo

-

+ +

+

+ -

Anticuerpos monoclonales

Cultivo en grandes volúmenes

Recuperar y purificar el AcMo secretado

Anticuerpos monoclonales
• Ventajas con respecto a los policlonales: •Alta especificidad, reconocen un único epitopo • Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas características. • Desventajas: • Mayor costo

Ejemplos

• Cualitativo o de identificación: • Cuantitativo: ELISA

inmunoblot

• Inmunoblot • Ejemplo: Supongamos que queremos saber si están presentes en un suero los anticuerpos que reconocen la banda de PM = 30 kDal del antígeno deToxoplasma gondii.

kDa

94 43 30 14.4

SDS-PAGE

Dirección de la electroforesis

log PM

Rf

Transferencia

nitrocelulosa

Incubación con el suero problema

Conjugado enzimático

Sustrato

Producto insoluble

Ejemplos:
• Etapas principales: • separación por electroforesis según pesos moleculares (SDS-PAGE), • transferencia a membrana de nitrocelulosa , incubacióncon suero problema, • incubación del conjugado (por ejemplo enzimático), • revelado y • examen contra patrón de pesos moleculares.

Clasificación de inmunoensayos
• Caótica en general, variados criterios de clasificación • • • • • a) diseño competitivo o no competitivo b) homogéneos y heterogéneos c) por el método de detección d) con o sin marcado e) por el tipo de marca

Según el diseño delensayo

De reactivo limitado o competitivos (inmunoensayos propiamente dichos)

De reactivo en exceso o no competitivos (ensayos inmunométricos)

• Competitivos: • Inmunoensayos en que se utiliza el marcado de antígeno o anticuerpo. • Una cantidad limitada de anticuerpos que es insuficiente para unir todo el antígeno. • El antígeno marcado compite con el antígeno sin marcar por losanticuerpos. La cantidad de analito se determina a partir de la regresión correspondiente.

Competitivo- Captura de anticuerpos
E +
Ag muestra

Ac marcado

E E
Sustrato

Señal

Ag muestra + Ac marcado

Señal

[Ag] Ag]

Competitivo- Captura de antígeno
Señal

Antígeno marcado Muestra [Ag] Ag] Señal

Lavado

Métodos no competitivos o inmunométricos
• El antígeno a...