His-Gpn
Páginas: 8 (1930 palabras)
Publicado: 3 de diciembre de 2012
PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE HIS-GPN2 PARA LA GENERACIÓN DE UN ANTICUERPO POLICLONAL EN CONEJO
Hernández Meza J.M., Sánchez Olea R., Calera Medina M. R., Reyes Pardo H.
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SAN LUIS POTOSÍ; INSTITUTO DE FISICA
Resumen
La proteína GPN2 es un miembro de una familia pequeña de proteínas G que incluye, además, a la GPN1 y a la GPN3. Estas tres proteínascomparten un alto porcentaje de identidad en su secuencia de aminoácidos y se asocian físicamente entre sí, pero se desconoce cuál es su función a nivel molecular. La proteína GPN2 está muy conservada durante la evolución y se encuentra catalogada como esencial en diversos organismos, pero aún se ignoran aspectos tan básicos como son el patrón de expresión y la localización subcelular de estaproteína, los cuales sería factible realizar si existiera un anticuerpo específico. En el presente trabajo se aplicaron métodos básicos de ADN recombinante para producir y purificar la proteína His-GPN2 de origen humano en bacterias. La proteína His-GPN2 se dirigió a los cuerpos de inclusión bacterianos y se localizó, por lo tanto, en la fracción insoluble. La utilización en condicionesdesnaturalizantes (cloruro de guanidinio 6M) permitió solubilizar y purificar exitosamente a la proteína His-GPN2. Con el propósito de sustituir el cloruro de guanidinio por una solución salina inerte la proteína recombinante purificada se dializó contra PBS. La concentración final de proteína se cuantificó midiendo la absorbencia de solución conteniendo la His-GPN2 a la luz ultravioleta. Finalmente, laHis-GPN2 se envió a la compañía americana Harlan para la elaboración de un anticuerpo policlonal en conejos. La disponibilidad de un anticuerpo efectivo y específico nos permitirá acelerar el estudio de la función molecular de la proteína GPN2 y establecer porqué es una proteína esencial para los seres vivos.
Introducción
La tecnología del DNA recombinante ha jugado un papel muy importante en eldesarrollo de la biotecnología de proteínas, ya que a través de la manipulación de genes es posible producir cantidades abundantes de algunas proteínas que se encuentran en niveles muy bajos en su ambiente natural. Se considera una proteína recombinante o proteína heterologa aquella cuya síntesis se lleva a cabo en un organismo diferente al nativo. Varios sistemas hospederos están disponibles paraeste propósito, incluyendo bacterias, levaduras, plantas, hongos filamentosos, insectos ó mamíferos.
Para expresar una proteína de interés en algún organismo hospedero se requiere primero de la selección apropiada de un vector de expresión, típicamente un plásmido bacteriano o un vector retroviral. Un vector es cualquier vehículo utilizado para transferir un DNA extranjero a otra célula. Parapermitir la inserción del gen de interés en el vector éste posee una colección de sitios únicos para enzimas de restricción inmediatamente después de una secuencia promotora de la transcripción.
Para la selección de un sistema hospedero adecuado y la elección final del vector se debe tener en cuenta las necesidades específicas de la aplicación y, por supuesto, la decisión estará influenciada porlas propiedades de la proteína blanco. Un factor clave que ha conducido a un mayor uso de los vectores que dirigen la expresión de una proteína de fusión formada por la proteína de interés unida a una etiqueta de tamaño conocido cuya función es la de facilitar el posterior aislamiento, purificación y detección de la proteína recombinante. Las dos etiquetas más utilizados con este fin son laenzima glutatión S-transferasa (GST etiqueta) y una secuencia de seis residuos del aminoácido histidina.
Las proteínas con una etiqueta de histidinas se pueden purificar y detectar con facilidad, ya que la cadena de residuos de histidina se une, en condiciones específicas, a varios tipos de iones metálicos inmovilizados, tales como el níquel, el cobalto y el cobre.
El objetivo de este estudio...
Hernández Meza J.M., Sánchez Olea R., Calera Medina M. R., Reyes Pardo H.
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SAN LUIS POTOSÍ; INSTITUTO DE FISICA
Resumen
La proteína GPN2 es un miembro de una familia pequeña de proteínas G que incluye, además, a la GPN1 y a la GPN3. Estas tres proteínascomparten un alto porcentaje de identidad en su secuencia de aminoácidos y se asocian físicamente entre sí, pero se desconoce cuál es su función a nivel molecular. La proteína GPN2 está muy conservada durante la evolución y se encuentra catalogada como esencial en diversos organismos, pero aún se ignoran aspectos tan básicos como son el patrón de expresión y la localización subcelular de estaproteína, los cuales sería factible realizar si existiera un anticuerpo específico. En el presente trabajo se aplicaron métodos básicos de ADN recombinante para producir y purificar la proteína His-GPN2 de origen humano en bacterias. La proteína His-GPN2 se dirigió a los cuerpos de inclusión bacterianos y se localizó, por lo tanto, en la fracción insoluble. La utilización en condicionesdesnaturalizantes (cloruro de guanidinio 6M) permitió solubilizar y purificar exitosamente a la proteína His-GPN2. Con el propósito de sustituir el cloruro de guanidinio por una solución salina inerte la proteína recombinante purificada se dializó contra PBS. La concentración final de proteína se cuantificó midiendo la absorbencia de solución conteniendo la His-GPN2 a la luz ultravioleta. Finalmente, laHis-GPN2 se envió a la compañía americana Harlan para la elaboración de un anticuerpo policlonal en conejos. La disponibilidad de un anticuerpo efectivo y específico nos permitirá acelerar el estudio de la función molecular de la proteína GPN2 y establecer porqué es una proteína esencial para los seres vivos.
Introducción
La tecnología del DNA recombinante ha jugado un papel muy importante en eldesarrollo de la biotecnología de proteínas, ya que a través de la manipulación de genes es posible producir cantidades abundantes de algunas proteínas que se encuentran en niveles muy bajos en su ambiente natural. Se considera una proteína recombinante o proteína heterologa aquella cuya síntesis se lleva a cabo en un organismo diferente al nativo. Varios sistemas hospederos están disponibles paraeste propósito, incluyendo bacterias, levaduras, plantas, hongos filamentosos, insectos ó mamíferos.
Para expresar una proteína de interés en algún organismo hospedero se requiere primero de la selección apropiada de un vector de expresión, típicamente un plásmido bacteriano o un vector retroviral. Un vector es cualquier vehículo utilizado para transferir un DNA extranjero a otra célula. Parapermitir la inserción del gen de interés en el vector éste posee una colección de sitios únicos para enzimas de restricción inmediatamente después de una secuencia promotora de la transcripción.
Para la selección de un sistema hospedero adecuado y la elección final del vector se debe tener en cuenta las necesidades específicas de la aplicación y, por supuesto, la decisión estará influenciada porlas propiedades de la proteína blanco. Un factor clave que ha conducido a un mayor uso de los vectores que dirigen la expresión de una proteína de fusión formada por la proteína de interés unida a una etiqueta de tamaño conocido cuya función es la de facilitar el posterior aislamiento, purificación y detección de la proteína recombinante. Las dos etiquetas más utilizados con este fin son laenzima glutatión S-transferasa (GST etiqueta) y una secuencia de seis residuos del aminoácido histidina.
Las proteínas con una etiqueta de histidinas se pueden purificar y detectar con facilidad, ya que la cadena de residuos de histidina se une, en condiciones específicas, a varios tipos de iones metálicos inmovilizados, tales como el níquel, el cobalto y el cobre.
El objetivo de este estudio...
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