histologia

Electroforesis de Ácidos Nucleicos en Gel de Agarosa

Electroforesis es la migración de las moléculas cargadas presentes en una solución acuosa como respuesta a la presencia de un campo eléctrico, dichas moléculas son atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Dos fuerzas de acción opuesta determinan la velocidad de la partícula en cuestión. Por un lado, la fuerza eléctrica, que la atraeal electrodo, cuya intensidad es directamente proporcional a la carga, y, de acuerdo a la segunda ley de Newton (F=m x a, entonces a=F/m), le impone una aceleración directamente proporcional al cociente carga/masa (q/m). Por otro lado, la fuerza de rozamiento, que se opone a la migración con una intensidad que depende del tamaño y la forma de la partícula y de las características del medio(viscosidad y estructura, por ejemplo).
La electroforesis es una técnica habitual en el laboratorio clínico. Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre unsoporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. La tinción del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración. El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimarcomparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas. Así por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a individuo enfermo, para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la obtención de unfragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extraído para análisis posteriores.
Los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo.
La agarosa puede se utilizada como soporte para la corrida electroforética. La agarosaes un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida. Esta característica permite una fácil preparación de una matriz porosa para ser usada en electroforesis: simplemente se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en un amortiguador adecuado, se calienta y se “chorrea”sobre un molde particular.
La concentración de agarosa típicamente utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%. La concentración a usar se escoge según el tamaño del ácido nucleico a analizar. Esto porque la concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la matriz, a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los ácidosnucleicos lineales con un alto peso molecular migrarán al ánodo más lentamente que ácidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La razón de esto es que los ácidos nucleicos de alto peso tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de ácidos nucleicos no linealizados, como plásmidos circulares en conformación nativa, la migración no solo dependerá del peso molecular sinotambién de otros aspectos como el grado de superenrrollamiento que éste poseea. Generalmente en una preparación de plásmido se pueden observar distintas conformaciones de la misma molécula, la forma superenrrollada, la forma semi relajada y una relajada.

La electroforesis se utiliza en el laboratorio para separar macromoléculas en solución, en forma analítica (es decir, sólo para verlas) o...