historia

La secuenciación del ADN con inhibidores de terminación de cadena
RESUMEN Un método nuevo para determinar las secuencias de nucleótidos en el ADN se
describe. Es similar al método "más y menos" [Sanger, F. & Coulson, AR (1975) J. Mol. Biol.
94,441-4481 sino que hace uso de la 2 ', 3'-didesoxi y análogos arabinonucleósido de los
trifosfatos de desoxinucleósidos normales, que actúan comoinhibidores específicos de
terminación de cadena de ADN polimerasa. La técnica se ha aplicado con el ADN de bacteriófago
4bX174 y es más rápido y más preciso que sea el más o menos el método.
El método de "más y menos" (1) es una
técnica relativamente rápida y simple que
ha hecho posible la determinación de la
secuencia del genoma del bacteriófago
4X174 (2). Depende de la utilización de la
ADNpolimerasa para transcribir regiones
específicas del ADN bajo condiciones
controladas. Aunque el método es mucho
más rápido y sencillo que otras técnicas
disponibles, ni el "plus" ni el método
"menos" es completamente exacta, y con el
fin de establecer una secuencia tanto debe
ser utilizado en conjunto, y datos
confirmatorios a veces son necesarias. W.
M. Barnes (J. Mol. Biol., En prensa)ha
desarrollado recientemente un tercer
método, que implica la sustitución de ribo,
que tiene ciertas ventajas sobre el método
de más y menos, pero esto todavía no se ha
explotado
ampliamente.
Otro método rápido y simple que depende
de la degradación química específica del
ADN ha sido recientemente descrito por
Maxam y Gilbert (3), y esto también se ha
utilizado ampliamente para lasecuenciación
del ADN. Tiene la ventaja sobre el método
más y menos que se puede aplicar a ADN de
doble hebra, pero requiere una separación
de las cadenas o fraccionamiento
equivalente de cada fragmento de enzima
de restricción estudiado, lo que hace que
sea algo más laborioso. Este artículo
describe un método adicional utilizando

ADN polimerasa, que hace uso de los
inhibidores de la queterminan las cadenas
recién sintetizadas en los residuos
específicos.
El Principio del método. Atkinson et al. (4)
Mostró que la actividad inhibidora de 2 ', 3'didesoxitimidina trifosfato (ddTTP) en el
ADN polimerasa I depende de su siendo
incorporada en la creciente cadena de
oligonucleótido en el lugar de ácido
timidílico (dT). Debido a que el ddT contiene
ningún grupo 3'-hidroxilo, lacadena no
puede extenderse más allá, de modo que la
terminación se produce específicamente en
las posiciones donde debería ser
incorporada dT. Si un cebador y el molde se
incuban con ADN polimerasa en presencia
de una mezcla de ddTTP y dTTP, así como
los otros tres desoxirribonucleósidos
trifosfato (uno de los cuales está marcado
con 32P), una mezcla de fragmentos que
tienen todas elmismo 5 'y con residuos de
DDT en los extremos 3 'se obtiene. Cuando
esta mezcla se fracciona por electroforesis
en geles de acrilamida desnaturalizantes el
patrón de bandas muestra la distribución de
DTS en el ADN recién sintetizado. Mediante
el uso de terminadores análogos para los
otros
nucleótidos
en
incubaciones
separadas y corriendo las muestras en
paralelo en el gel, se obtiene unpatrón de
bandas a partir del cual la secuencia puede

leerse como en las otras técnicas rápidas
mencionados anteriormente.
Dos tipos de trifosfato de terminación se
hayan
derivados
dideoxy
y
los
arabinonucleosides los utiliza-. La arabinosa
es un estereoisómero de la ribosa en la que
el grupo 3'-hidroxilo está orientado en la
posición trans con respecto al grupo2'hidroxilo. Elarabinosil (ARA) los
nucleótidos de terminación de cadena
actúan como inhibidores de Escherichia
ADN polimerasa I de E. coli de una manera
comparable al DDT (4), aunque las cadenas
sintetizadas que terminan en 3 'araC se
pueden extender aún más por algunos
polimerasas de ADN de mamíferos (5). Con
el fin de obtener un patrón adecuado de las
bandas de las que una extensa secuencia
puede ser...