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PRÁCTICA Nº 2
EXTRACCIÓN DE DNA
A. PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS (LISIS ALCALINA)
1. Inocular un tubo de 5 mL de medio de cultivo líquido con la cepa de interés, más el
antibiótico adecuado. IncubarO.N.
2. Centrifugar en eppendorf los 5 mL de cultivo celular. 1 minuto 14,000 rpm. Eliminar
sobrenadante
3. Resuspender el botón celular en 200 μL de Solución I
4. Agregar 200 μL de Solución II(recién preparada). Mezclar por inversión e incubar en
hielo por 5 minutos
5. Adicionar 200 μL de Solución III fría. Mezclar por inversión. Incubar en hielo por 10
minutos
6. Centrifugar 10 minutosa 14,000 rpm. Antes de centrifugar mezclar suavemente por
inversión del tubo.
7. Transferir el sobrenadante a otro tubo por medio del uso de pipeta y adicionar 800 μL
de etanol 100%. Mezclar porinversión. Incubar por 2 minutos a temperatura ambiente
8. Centrifugar 10 minutos a 14,000 rpm
9. Eliminar sobrenadante y adicionar 500 μL de etanol al 70%. Centrifugar 1 minuto a
14,000 rpm.Eliminar sobrenadante y repetir proceso
10. Dejar secar la muestra
11. Resuspender en 50 μL de Tris:EDTA (TE) 10:1
12. Correr gel de agarosa (1 %)
SOLUCIÓN I
Dextrosa 50 mM, tris 25 mM pH 8.0, EDTA 10mM pH 8.0
Dextrosa 2.252 g 0.901 g
EDTA 0.5 M pH 8.0 5 mL 2 mL (ajustar pH NaOH 10 M)
Tris-HCl 2 M pH 8.0 3.125 mL 1.25 mL (ajustar pH HCL 6 M)
Agua destilada hasta 250 mL 100 mL

Esterilizar enautoclave. Esterilizar de manera separada



SOLUCIÓN II
SDS 1 %, NaOH 0.2 M
Preparar las soluciones por separado (SDS 10 % y NaOH 10 M). No es necesario
esterilizarlas. (SDS: sodio dodecilsulfato)
La Solución II se prepara al momento de realizar la lisis alcalina en la siguiente proporción:
SDS 10 % 0.5 mL 100 μL
NaOH 10 M 0.1 mL 20 μL
Agua destilada 4.4 mL 880 μL
SOLUCIÓN IIIAcetato de potasio 5 M 60 mL
Ácido acético glacial 40 mL
Total 100 mL
La solución debe almacenarse a 4 ºC y usarse fría
RNAsa
Solución preparada a una concentración de 4 mg/mL
Debe adicionarse en...