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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
En Abril de 1983, Kary Mullis dio a conocer la Técnica de reacción en cadena de la Polimerasa o PCR que es una técnica para la síntesis "in Vitro" de secuenciasespecíficas de DNA con la cual la insuficiente cantidad de ADN ya no es un problema en los procedimientos de Biología Molécular ni en los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio de DNA.La técnica se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5´-> 3´usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucleótidossintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea amplificar.
Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la Polimerasa se basaen la repetición de un ciclo formado por tres etapas:
1ª Desnaturalización del ADN doble cadena
2ª Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras
3ª Extensión delcebador por actuación de la DNA polimerasa
En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altastemperaturas (93-97ºC). La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.
En el segundo paso (hibridación) los cebadores se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el fragmento quequeremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65º C)
En la tercera etapa (elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doblecadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Todos estos...