HOLA

• Temperatura: el ovocito es el elemento más sensible a la temperatura de todo el laboratorio. Si ésta bajo de 34 °C el huso meiótico despolimerizará, y cuando se vuelva a forma puede crear anomalías cromosómicas, de forma que el ovocito será fecundable pero no dará lugar a un embrión normal.
Se deben aislar los complejos cúmulo-corona-ovocitos que se llegan a observar a simple vista (varios mmde diámetro).
• Medios: durante este proceso se emplean diferentes medios de cultivo con diferente composición:
• En los tubos: 0,1ml de medio tamponado (HEPES) con heparina para evitar la formación de coágulos.
• El medio HEPES (que debe estar desde el día anterior a ser utilizado en una estufa a 37 °C) acumulará temporalmente los cúmulos mientras se realiza la punción. Además será empleadopara lavar y reducir el tamaño de los cúmulos antes de pasar al incubador.
• Placas de cultivo: con un medio simple rico en glucosa (por ejemplo HTF + HSA 10 mg/ml) para mantenerlos en el incubador al 5% dióxido de carbono. El medio debe estar desde el día anterior a ser utilizado en el incubador a 37 °C y 5% de dióxido de corbono.
Las punciones se programan normalmente cada 30 minutos aunque labúsqueda de los ovocitos no suele durar más de 15 minutos. En estos procesos se utiliza anestesia local, general o parcial para evitar el dolor producido por la punción.
Fecundación
Una vez en el laboratorio, los complejos cúmulo corona ovocito extraídos se lavan en medio HEPES para mantener el pH, recortando las células de la granulosa que los rodean y preparándolos para la fecundación. Losovocitos deben permanecer al menos 4 horas en el incubador (medio simple rico en glucosa) hasta su inseminación, es decir, aproximadamente 40 horas tras la inducción de la ovulación que sería el momento de la ovulación espontánea.
Al mismo tiempo, el semen se prepara para la fecundación, eliminando las células inactivas, el fluido seminal y se realiza su capacitado. Los parámetros adecuados de semencapacitado para realizar FIV son: 5-10 millones de espermatozoides por mililitro, más de 75% de espermatozoides móviles progresivos y más de 1% de formas normales. Si la muestra seminal posee valores inferiores a los anteriores, se recurre a ICSI en lugar de FIV. Si el semen proviene de un donante, probablemente habrá sido preparado antes de ser congelado y puesto en cuarentena, y cuando seadescongelado estará listo para usar.
Existen distintos protocolos de FIV pero todos se basan en el mismo principio: el esperma y el ovocito se incuban juntos (en un ratio de aproximadamente 75.000:1) en un medio de cultivo simple con glucosa durante unas 18 horas. Concentraciones superiores de espermatozoides pueden producir fecundaciones anómalas (poliespermia) y una menor concentración deespermatozoides puede producir fallos de fecundación.
Trascurrido 16-18 horas se comprueba la fecundación, que ya debería haber ocurrido. Como los ovocitos se fecundan en los primeros 20 minutos de exposición. Hay autores que a la media hora lavan los ovocitos para evitar la exposición a ROS, que pude formarse por la presencia de espermatozoides muertos.
El cigoto humano de 15 a 20 horas tras la concepciónpermanece en el estadio de pronúcleos (PN). Se considera que la fecundación es correcta cuando el cigoto presenta dos PN y dos corpúsculos (CP). A veces es difícil interpretar los CP y se valoran como correctamente fecundado cualquier embrión con dos PN. Cualquier otra combinación se considera anormal y se descarta. La mayoría de las veces aparece primero el PN paterno en la posición central y elmaterno se acerca más tarde. Para poder valorar correctamente la fecundación, es necesario decumular previamente el cigoto. Es importante que en FIV no se decumule el ovocito antes de la fecundación, ya que conlleva alta probabilidad de polispermia.
El óvulo fecundado se pasa a un medio de cultivo simple (como HTF/HSA) o secuencial (G1 de Vitrolife) y se mantiene durante alrededor de 48h...