Hormonas

Tirotropina (TSH)
Determinación cuantitativa de la concentración de trirotropina en suero humano por ensayo inmunoenzimometrico con microplacas.
Explicación de la prueba
La trirotropina es una glicomolecula secretada por la hipófisis anterior, y es considerada con el indicador más sensible para el diagnostico de hipotiroidismo primario y secundario. Es un marcador sensible y temprano de ladisminución de la reserva tiroidea y en conjunto con la disminución de las concentraciones de tiroxina (t4) diagnostica hipotiroidismo primario. El incremento esperado en las concentraciones de TSH demuestra el sistema de retroalimentación negativo entre las glándulas pituitaria y tiroides. Las mediciones de TSH son útiles para la diferenciación entre hipotiroidismo secundario.
Después de completarel periodo de incubación requerida, el anticuerpo unido al conjugado de enzima-tirotropina, es separado del conjugado no unido enzima-tirotropina por la aspiración o decantación. La actividad de la enzima presente en la superficie del pozo es cuantificada mediante la reacción con un sustrato adecuado para producir color.
Reactivos
A. Calibradores de tirotropina – 1ml/vial – Iconos A-G
7viales de referencias para el antígeno TSH a niveles de 0 (A), 0.5 (B), 2.5 (C), 5.0 (D), 10 (E), 20 (F), 40 (G) uUI/ml.
B. Reactivo de enzima – TSH – 13ml/vial
Un vial que contiene anticuerpo policlonal de caba purificado con afinidad a la enzima marcada, igG de ratón monoclonal marcado con biotina en buffer, secado y preservado.

C. Micropipeta cubierta de estreptatidina – 96 pozos
Unamicroplaca de 96 pozos cubiertas con estreptatidina y empaquetada en una bolsa de aluminio con un agente de secado.

D. Concentrado de solución de lavado 20ml
Un vial que contiene un surfractante en suero salino tamponado.

E. Substrato A – 7ml/vial
Una botella que contiene tetrametilbenzidina en buffer.

F. Substrato B – 7ml/vial
Una botella que contiene peróxido de hidrogeno en buffer.G. Substrato stop – 8ml/vial
Una botella que contiene un acido fuerte.
Materiales requeridos no proporcionados
Pipetas para volúmenes requeridos
Dispensador para las distribuciones repetidas.
Lavador de microplaca o una botella de lavado.
Lector de microplaca con capacidad de absorbancia de longitud de onda de 450nm a 620nm.
Papel absorbente para borrar los pozos de la microplaca
Cubiertaplástica o de microplaca para los pasos de incubación.
Aspirador al vacio o vacuo para el lavado
Contenedor de almacenaje para buffer.
Agua destilada
Recolección de muestra
Debe obtenerse sangre venosa en ayunas, sin aditivos. Dejar que la sangre coagule. La muestra puede ser refrigerada por un periodo de 5 días.
Preparación de reactivos
1. Buffer para lavado: diluir los contenidos delconcentrado de lavado a 1000 ml de agua destilada.
2. Solución de substrato de trabajo: vierta los contenidos del vial ámbar marcada con A dentro del vial claro marcado como solución B. mezclar e identificar.
Procedimiento
1. Llevar los reactivos a temperatura ambiente.
2. Pipetear 50ul del calibrador, dentro del pocillo asignado.
3. Adicionar 100ul de reactivo de enzima a cada pozo.
4.Mezclar la microplaca ligeramente por 20-30 segundos.
5. Incubar por 60 minutos a temperatura ambiente.
6. Adicionar 350ul de buffer de lavado, decantar, repetir dos veces más.
7. Adicionar 100ul de solución de substrato de trabajo a todos los pozos.
8. Mezclar la microplaca
9. Adicionar 50ul de solución de parada a cada pozo.
10. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos.
11. Leer laabsorbancia de cada pozo entre 450 y 630nm, dentro de los 30 minutos siguientes al adicionado de la solución de parado.




Cálculos de resultados
Una curva dosis respuesta es usada para hallar en la concentración de TSH en muestras desconocidas.
1. Registrar la absorbancia obtenida del listado del lector de microplacas.
2. Compararla con los resultados existentes en la lista.
3. Hacer el...