Hplc

HPLC Cromatografía Líquida

1 La Cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las substancias analizadas y lacolumna cromatográfica. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial quepermita trabajar con las altas presiones requeridas. Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser:

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• Cromatografía de adsorción: La fase fija es un sólido y se utiliza casi exclusivamente sílice (sílica) y en mucha menor medida alúmina.

• Cromatografía de reparto: En casi todos loscasos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos químicamente a un soporte sólido de sílica. Se la subdivide encromatografía en fase normal y fase reversa. En la cromatografía en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo agua o trietilenglicol) y los compuestos menos polares eluyen primero. En la cromatografía en fase reversa, el compuesto unido químicamente es unhidrocarburo alifático y se emplean fases móviles polares. En este caso, las sustancias más polares eluyen primero.

• Cromatografía iónica: Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio iónico para separar y determinar iones.

• Cromatografía de exclusión por tamaño: La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros y llevan acabo un fraccionamiento realcionado con el tamaño molecular. Las moléculas de tamaño mayor son excluídas y eluyen primero, mientras que las más pequeñas que penetran en los poros son retenidas más tiempo.

Diferencias entre GC y HPLC

Características de ambos métodos

• Son eficientes, muy selectivos, ampliamente aplicables.

• Sólo se requiere una muestra pequeña.

• Puedenutilizarse sin destruir la muestra.

• Se adapta fácilmente al análisis cuantitativo.

Ventajas de la HPLC:

• Puede acomodar muestras no volátiles e inestable térmicamente.

• Es aplicable a iones inorgánicos.

Ventajas de la CG:

• Se trata de un equipo sencillo y barato en comparación con HPLC.

• Es rápido.

• Tiene resolución en paralelo (columnascapilares).

• Se conecta fácilmente con la espectroscopia de masas, (MS). La CG, ofrece la ventaja de la velocidad y simplicidad del equipo, pero la HPLC es aplicable a sustancias no volátiles y materiales térmicamente inestables.

Algunas diferencias instrumentales:

• En HPLC no existen detectores tan aplicables universalmente, ni tan tampoco tan fiables como en CG.

• El detectoren HPLC no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas.

• El detector usado en HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.

Tipos de columnas y sus dimensiones

Normalmente son de acero inoxidable de diámetro interno uniforme aunque en ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes.

La mayoría delas columnas de cromatografía de líquidos tienen una longitud entre 10 y 30 cm. Generalmente son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas. El diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10m.

Los empaquetados más comunes son de partículas de sílice pero también se usa la...