Hplc

Universidad Nacional de La Plata
Licenciatura en Química
Química Analítica III TP 12
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución
Introducción
La cromatografía de líquidos es un método de separación física basado en la distribución de los
componentes de una mezcla entre una fase estacionaria y una fase móvil que en este caso es un
líquido. La cromatografía líquida “clásica” se lleva a caboen una columna generalmente de vidrio, la
cual está rellena con la fase estacionaria. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace
fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la
eficiencia en las separaciones el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el
tamaño de los micrones lo cual generó la necesidadde utilizar altas presiones para lograr que la fase
móvil fluya a velocidades razonables. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones
requeridas. Dependiendo del tipo de fase estacionaria y del tipo de fenómeno físico que provoca la
separación, la cromatografía líquida dealta resolución puede clasificarse en:
1. Cromatografía de adsorción: La fase estacionaria es un sólido y se utiliza casi
exclusivamente sílice (sílica) y en casos discretos alúmina.
2. Cromatografía de reparto o partición. Actualmente se utiliza como fase estacionaria
compuestos ligados químicamente a un soporte sólido de sílice. Se puede subdividir en cromatografía
en fase normal y en faseinversa (usualmente mal llamada reversa por traducción de “reversed”). En la
cromatografía en fase normal la fase estacionaria es polar (como por ejemplo sílice) y la fase móvil es
poco polar (hexano, diclorometano, cloroformo). En esta modalidad los compuestos mas polares
quedan mas retenidos mientras que los menos polares eluyen primero. En la cromatografía en fase
inversa, el compuestounido químicamente es no polar, frecuentemente hidrocarburo alifático, y se
emplean las fases móviles son solventes polares (agua, metanol, acetonitrilo). En este caso, las
sustancias más polares eluyen primero y las hidrofóbicas quedan mas retenidas.
3. Cromatografía de iónes.: Se utilizan columnas rellenas con fases estacionarias con una
determinada carga que retienen iones de carga opuesta.Las fases estacionarias para la modalidad
clásica de esta cromatografía son las resinas de intercambio iónico.
4. Cromatografía de exclusión por tamaño: La fase estacionaria está formada por partículas de
porosidad definida y uniforme. Las moléculas de mayor tamaño tienen menor capacidad para acceder
a los poros y por mantenerse “excluidas” eluyen mas rápido, mientras que las de menor tamaño quepueden penetrar en los poros y permanecer allí mas tiempo eluyen en último lugar.
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Instrumental
Un equipo para cromatografía líquida de alta resolución puede representarse por el siguiente
esquema:
La fase móvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de una
mezcla, puedeprogramarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una proporción
determinada y realice la mezcla en una cámara de mezclado. Cuando durante toda la separación se
utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrática, sin embargo es normal realizar gradientes
de composición de solvente para aumentar el rango de polaridades de sustancias a separar acortando el
tiempototal de análisis. Estos gradientes de solvente también son realizados en forma automática por
las bombas. La bomba envía al solvente hacia la válvula inyectora a través de tuberías de diámetro
pequeño, de acero inoxidable o de plásticos especiales. La válvula inyectora suele ser una válvula de
seis vías cuyo esquema se muestra en la figura:
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