HPLC

Curso de Análisis Instrumental

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA
EFICACIA (HPLC)

Instituto de Ingeniería Química
Facultad de Ingeniería - 2007

Ampliamente utilizada
Gran sensibilidad
Determinaciones cuantitativas exactas

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
DE ALTA EFICACIA (HPLC)

Determinación de compuestos no volátiles (alto Peso Molecular,
iones metálicos) o termolábiles.Aplicabilidad a sustancias de interés general (industria, salud,
medioambiente).
Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos,
carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos,
esteroides, etc.

Juan Bussi

Solventes como Fase Móvil
Interacciones químicas entre la muestra, la fase móvil y el relleno
de la columna, determina el grado de migración y separación decomponentes contenidos en la muestra.
Compuestos con interacciones más fuertes con la fase móvil que
con la fase estacionaria eluirán más rápidamente de la columna
(tiempos de retención menores).
La fase móvil puede ser alterada en el transcurso del análisis para
manipular las interacciones de los componentes de la muestra con
la fase estacionaria.
•Elución Isocrática: composición constante de lafase móvil
•Elución por gradiente: los distintos analitos son eluídos
con incremento de la composición de la fase móvil en la fase
orgánica.
•Elución politíptica: se combinan varios tipos de técnicas.

1

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

Definiciones

Polaridad creciente
Insoluble en agua

Soluble en agua
Iónico

No Polar
No Iónico Polar

PesoMolecular

102

103

Reparto

Adsorción
(Reparto
en fase
inversa)

(Reparto
en fase
normal)

Intercambio
iónico

Velocidad lineal media v = u x ft
Velocidad de migración u
1

v=ux

104

105

Coeficiente de distribución K = cS/cM
Tiempo de retención: tM

1 + KVS/VM

Exclusión por
tamaño
(Penetrabilidad
sobre gel)

(Filtración
sobre gel)

106

Distintos métodos soncomplementarios.

Factor de capacidad de una especie A:
k’A = KA VS/VM
tR – tM
k’A =
tM

Eficacia de columnas para HPLC

Factor de selectividad para dos especies A y B
(tR)B – tM
α = KB/KA = k’B/k’A =
(tR)A – tM
Altura de plato teórico H = σ2/L
Nº de platos teóricos N = L/H

Conceptos de Altura de Plato Teórico y factores que lo afectan
como en otras cromatografias.
H = A + B/u + (CS +CM) u
(ecuación de Van Deemter)
Velocidades lineales menores
que en CG
Altura de plato menor que en
GC (1 orden de magnitud).
Longitud de columnas menor
(25 a 50 cm).

2

Efecto del tamaño de partícula del relleno
CS y CM ∝ dP2
Aumento de eficiencia con disminución del tamaño de partícula
(tamaño usuales entre 2 y 10 µm

Ensanchamiento extracolumna
Debido a diferencias develocidad entre distintas capas del
líquido que se desplaza en tubos de inyección, de conexión y
detectores.
Gradientes no se compensa por difusión.
Hex =

π r 2u
24DM

Reducción del diámetro de
tubos a menos de 2.5 mm.

Efecto del tamaño de muestra
Más notorio en Adsorción y Reparto

3

Instrumentación
Elevadas presiones para alcanzar caudales necesarios.
Equipamiento sofisticado ycaro.

Recipientes para una o más fases móviles
De vidrio o acero de 0.2 a 1 L

Sistemas de pretratamiento de fases móviles

Cámara de mezcla para disolventes
Ventajas de la elución con gradiente (relación variable de
volúmenes de dos o más disolventes)
Mejora de resolución en tiempos de análisis más cortos.

Para eliminación de gases disueltos y sólidos en suspensión
desgasificaciónpor vacío
calentamiento

Sistemas de bombeo
Generación de presiones superiores a 6000 psi.

agitación
inyección de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio).

Caída de presión en una
columna:

Filtros para polvo y partículas sólidas en suspensión.

ηLu
∆P =

θ dP2

η: viscosidad
Método común: filtración a vacío a través de filtro millipore de
tamaño de poro muy pequeño...