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ANALISIS INSTRUMENTAL
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION

INTRODUCCION
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En
cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que
contiene a la fase fija.
La cromatografía líquida“clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la
cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir
la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la
eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo
hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó lanecesidad de utilizar altas presiones para
lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas
presiones requeridas.
Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la
cromatografía líquida de alta resolución puede ser:1. Cromatografía de adsorción.
La fase fija es un sólido y se utiliza casi exclusivamente sílice (sílica) y en mucha menor
medida alúmina.
2. Cromatografía de reparto.
En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos
químicamente a un soporte sólido de sílica. Se la subdivide encromatografía en fase normal
y fase reversa.
En la cromatografía en fase normal, la fasefija es polar (como por ejemplo agua o
trietilenglicol) y los compuestos menos polares eluyen primero.
En la cromatografía en fase reversa, el compuesto unido químicamente es un hidrocarburo
alifático y se emplean fases móviles polares. En este caso, las sustancias más polares
eluyen primero.
3. Cromatografía iónica.
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio iónico para separar ydeterminar
iones.
4. Cromatografía de exclusión por tamaño.
La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red
uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento realcionado con el tamaño molecular.
Las moléculas de tamaño mayor son excluídas y eluyen primero, mientras que las más
pequeñas que penetran en los poros son retenidas más tiempo.

INSTRUMENTAL
Un equipopara cromatografía líquida de alta resolución puede representarse por el siguiente
esquema:

La fase móvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de una
mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una
proporción determinada y realice la mezcla en una cámara de mezclado. Cuando durante toda
la separación se utiliza siempre elmismo solvente, se denomina isocrática, sin embargo es

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normal realizar un gradiente de composición del solvente a lo largo de la cromatografía para
mejorar la eficiencia y acortar la duración del proceso. Estos gradientes de solvente también
son realizados en forma automatica por las bombas.
La bomba envía al solvente a través de caños de diámetro pequeño, generalmente de aceroinoxidable, hacia la válvula inyectora. Esta consiste en una válvula de seis vías que permite
introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado.
Luego de que se produzca la separación en la columna, los componentes de la mezcla pasan
por el detector. Este produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia y esa
señal es enviada al registrador querealiza un gráfico de intensidad en función del tiempo
(cromatograma) del tipo:

Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la
muestra original. El integrador calcula además el àrea correspondiente a cada pico, la cual es
proporcional a la cantidad de sustancia.
Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los productos que...