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GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

MICROBIOLOGÍA GENERAL

ÁREA MICOLOGÍA

AÑO 2011

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TRABAJO PRÁCTICO N° 1
Tema: Elementos a utilizar en el laboratorio de Micología
Técnicas de siembra y aislamiento.
Objetivos
Aislar hongos por los siguientes métodos: siembra espontánea,
agotamiento en superficie, técnica del anzuelo queratinoso, diluciones
sucesivas y plaqueo directo de granos.Materiales
Caja de trabajo: ansa, espátula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos,
papel de filtro, gasa, colorante Gueguén, líquido de montar, KOH 20% P/V,
Tinta china (1:2 con agua destilada), pinza, espátula de Driglasky.
Tubos de ensayo estériles.
Tubos de centrífuga estériles.
Pipetas estériles.
Agua destilada y solución fisiológica estériles.
Tween 80 estéril.
Cloranfenicol (5%P/V en alcohol etílico).
Rosa de bengala (1/150).
Embudo y gasa.
Acido cítrico al 10%.
Ansa calibrada.
Pelos de caballo estériles.
Tubos con Sabouraud glucosa en plano inclinado y en columna.
Tubos con Sabouraud glucosa cloranfenicol en columna.
Erlenmeyers estériles.
Tubos con Agar Papa Dextrosa (APD) en plano inclinado y en columna.
Placas de Petri estériles.
Granos, materia fecal,tierra.
Técnicas

1) Aislamiento de hongos ambientales por siembra espontánea:
Se prepararan placas de Petri con medio de Sabouraud glucosa. Se colocan
las placas abiertas en lugares apropiados. Al cabo de 5 minutos se cierran las
placas y se incuban a 28° durante una semana. Obse rvar. Efectuar una
C
resiembra (repique) de las colonias de interés en tubos con agar inclinado para
obtener uncultivo puro.

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2) Aislamiento y recuento de levaduras por agotamiento en superficie:
Se siembran 10µl de orina completa, previamente agitada, en la superficie
de placas conteniendo medios de Sabouraud-glucosa y Sabouraud-glucosacloranfenicol. Se incuba a 28° durante una semana, realizando el recuento de
C
colonias y el aislamiento para la posterior identificación de las cepas deinterés.
Factor para recuento: 100

3) Aislamiento de hongos queratinofílicos por la técnica del anzuelo
queratinoso:
En una placa de Petri estéril se coloca una capa gruesa de la tierra en
estudio, sobre ella se depositan pelos de caballo estériles y se humecta. Se
incuba a 28° durante 15 a 30 días, aislándose lueg o los hongos de interés.
C

4) Aislamiento y recuento de hongos de suelo yalimentos por diluciones
sucesivas:
Se colocan 10 g de suelo cuya población fúngica se desea estudiar en un
erlenmeyer estéril, se agregan a 90 ml de agua destilada y se agita, obteniendo
luego una serie progresiva de diluciones (1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000).
En placas de petri estériles se mezclan 10 ml de APD con 0,1 ml de rosa de
bengala y 0,1 ml de cloranfenicol y se deja solidificar.Sobre las mismas se
siembran 0,1 ml de las diluciones 1/1000, 1/10000, 1/100000, dispersándolas
con espátula de Driglasky. Se incuba a 28° durante una semana. Se realiza el
C
recuento de colonias (en aquellas placas que contengan entre 30 y 300
colonias) y el aislamiento de las cepas de interés.
Esta técnica puede emplearse también para alimento finamente molido
sembrando las dilucionescorrespondientes en medio DRBC y DG18.

5) Plaqueo directo de alimentos particulados:
Para el aislamiento de cepas fúngicas a partir de alimentos particulados
(granos, semillas, trozos de alimentos) se emplea la técnica de plaqueo directo.
Los granos son desinfectados superficialmente sumergiéndolos 2 minutos en
una solución de hipoclorito de sodio (0.4 % de cloro activo – dilución 1/10 delavandina de uso doméstico). Después de escurrirlas, las partículas son
colocadas utilizando una pinza estéril, a razón de 8-10 granos por placa,
directamente sobre placas de medio DRBC (diclorán-rosa de bengalacloranfenicol-agar) y DG18 (diclorán 18 %-cloranfenicol-agar) que se incuban a
25 ºC durante 5 días.

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TRABAJO PRÁCTICO N° 2
Tema: Macromorfología de las colonias fúngicas...