Ibmc Cloroplastos
Páginas: 7 (1517 palabras)
Publicado: 3 de septiembre de 2011
INTRODUCCIÓN
La fotosíntesis, en un conjunto de procesos físicos, químicos y bioquímicos que se basan en la captación y transferencia de energía lumínica, para luego ser almacenada en forma de energía química. Se utiliza para trasformar el CO2 de la atmósfera en hidratos de carbono, al mismo tiempo que se reduce el sulfato y el nitrato. El tipo de fotosíntesis mas frecuente es laoxigénica, que es la realizada por plantas, algas y cianobacteria. En esta, se consume H2O, CO2 y luz con el fin de generar O2.
En eucariotas, este proceso se lleva a cabo dentro de las organelas especializadas conocidas con el nombre de cloroplastos. El hecho de estar delimitados por dos típicas membranas, hace posible que para fines prácticos podamos aislarlos.
Durante la fasefotoquímica, se produce el fenómeno de captación de energía lumínica para su posterior conversión en energía química en forma de ATP y compuestos reducidos. Los responsables de captar los fotones de luz, son los llamados “complejos antena”, que transfieren los electrones desde el H2O hasta un aceptor final, el NADP. A esta transferencia de electrones mediada por la luz se la llama reacción de Hill. Junto coneste proceso de oxido reducción se fosforila el ADP, y se produce ATP y NADPH + H+, utilizados para la de fijación del CO2, en la etapa independiente de la luz.
Finalmente, vamos a intentar verificar que los cloroplastos estén fotosinteticamente activos.
Para esto, una manera fácil de hacerlo es agregar un aceptor de electrones exógeno, que sea fácil de revelar su reducción (por ejemplo:cambiar de color según este oxidado o reducido). El reactivo mas utilizado se llama DCPIP y cambia de color azul (oxidado) a incoloro (reducido).
DESARROLLO
En una primera instancia, se aislaron los cloroplastos. Esto se logra, lavando unos 200 gramos de espinacas frescas con H2O corriente, escurriendo y trozando las hojas en pedazos más o menos chicos y colocándolos en la licuadora.Luego se agregan 350 ml de BH10 frío y licuar de forma intermitente hasta lograr que las hojas tengan un tamaño de unos pocos milímetros. Se filtra por un tubo de algodón (humedecido en BH10) y centrifugo a 5000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Luego, se vuelca el sobrenadante con cuidado. Es importante resuspender el pellet de cloroplastos cuidadosamente (para evitar la formación de burbujas)en 2 ml de BH10 y dejarlos en hielo.
Mientras tanto otro miembro del equipo, en un tubo de plástico arma un gradiente de sacarosa. Agarrando una pipeta Pasteur, se va colocando contra la pared del tubo de manera sucesiva y lenta (para que no se mezclen las capas): Primero 8ml de BH60, luego 8ml de BH40 y por último 8 ml de BH20.
Una vez realizado esto, le agrego al tope del gradientetoda la suspensión de cloroplastos y centrífugo a 4ºC por un periodo de tiempo de 4 minutos a 7000 rpm.
Los cloroplastos enteros, quedan en la interfase entre BH40 y BH60, debemos retirar solo estos y luego pasarlos a un tubo de vidrio limpio con la pipeta Pasteur y dejar la suspensión en hielo.
Una vez que tenemos los cloroplastos aislados, procedemos a verificar la actividadfotosintética de los mismos. Esto los hago analizando reacciones en 4 tubos diferentes, que vamos a rotular del 1 al 3, incluyendo un tubo 3’ que se va a mantener en la oscuridad.
En el tubo 1 agregamos 4 ml de BH10. En el tubo 2 agregamos 3 ml de BH10 y 1 ml de DCPIP. En el 3 agregamos 3 ml de BH10 y 1 ml de DCPIP. Por último en el tubo 3’ agregamos 3 ml de BH10 y 1 ml de DCPIP.
Más adelante, acada uno de los tubos les agregamos la suspensión de cloroplastos, y agitamos los tubos suavemente y no debemos olvidarnos de colocar el tubo 3’ en la oscuridad. A partir de este momento comenzamos a tomar el tiempo y observamos cuanto tarda en llegar al efecto acromático.
Por otro lado, hay otros ensayos que se pueden hacer sobre la preparación de cloroplastos, con el fin de analizar...
La fotosíntesis, en un conjunto de procesos físicos, químicos y bioquímicos que se basan en la captación y transferencia de energía lumínica, para luego ser almacenada en forma de energía química. Se utiliza para trasformar el CO2 de la atmósfera en hidratos de carbono, al mismo tiempo que se reduce el sulfato y el nitrato. El tipo de fotosíntesis mas frecuente es laoxigénica, que es la realizada por plantas, algas y cianobacteria. En esta, se consume H2O, CO2 y luz con el fin de generar O2.
En eucariotas, este proceso se lleva a cabo dentro de las organelas especializadas conocidas con el nombre de cloroplastos. El hecho de estar delimitados por dos típicas membranas, hace posible que para fines prácticos podamos aislarlos.
Durante la fasefotoquímica, se produce el fenómeno de captación de energía lumínica para su posterior conversión en energía química en forma de ATP y compuestos reducidos. Los responsables de captar los fotones de luz, son los llamados “complejos antena”, que transfieren los electrones desde el H2O hasta un aceptor final, el NADP. A esta transferencia de electrones mediada por la luz se la llama reacción de Hill. Junto coneste proceso de oxido reducción se fosforila el ADP, y se produce ATP y NADPH + H+, utilizados para la de fijación del CO2, en la etapa independiente de la luz.
Finalmente, vamos a intentar verificar que los cloroplastos estén fotosinteticamente activos.
Para esto, una manera fácil de hacerlo es agregar un aceptor de electrones exógeno, que sea fácil de revelar su reducción (por ejemplo:cambiar de color según este oxidado o reducido). El reactivo mas utilizado se llama DCPIP y cambia de color azul (oxidado) a incoloro (reducido).
DESARROLLO
En una primera instancia, se aislaron los cloroplastos. Esto se logra, lavando unos 200 gramos de espinacas frescas con H2O corriente, escurriendo y trozando las hojas en pedazos más o menos chicos y colocándolos en la licuadora.Luego se agregan 350 ml de BH10 frío y licuar de forma intermitente hasta lograr que las hojas tengan un tamaño de unos pocos milímetros. Se filtra por un tubo de algodón (humedecido en BH10) y centrifugo a 5000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Luego, se vuelca el sobrenadante con cuidado. Es importante resuspender el pellet de cloroplastos cuidadosamente (para evitar la formación de burbujas)en 2 ml de BH10 y dejarlos en hielo.
Mientras tanto otro miembro del equipo, en un tubo de plástico arma un gradiente de sacarosa. Agarrando una pipeta Pasteur, se va colocando contra la pared del tubo de manera sucesiva y lenta (para que no se mezclen las capas): Primero 8ml de BH60, luego 8ml de BH40 y por último 8 ml de BH20.
Una vez realizado esto, le agrego al tope del gradientetoda la suspensión de cloroplastos y centrífugo a 4ºC por un periodo de tiempo de 4 minutos a 7000 rpm.
Los cloroplastos enteros, quedan en la interfase entre BH40 y BH60, debemos retirar solo estos y luego pasarlos a un tubo de vidrio limpio con la pipeta Pasteur y dejar la suspensión en hielo.
Una vez que tenemos los cloroplastos aislados, procedemos a verificar la actividadfotosintética de los mismos. Esto los hago analizando reacciones en 4 tubos diferentes, que vamos a rotular del 1 al 3, incluyendo un tubo 3’ que se va a mantener en la oscuridad.
En el tubo 1 agregamos 4 ml de BH10. En el tubo 2 agregamos 3 ml de BH10 y 1 ml de DCPIP. En el 3 agregamos 3 ml de BH10 y 1 ml de DCPIP. Por último en el tubo 3’ agregamos 3 ml de BH10 y 1 ml de DCPIP.
Más adelante, acada uno de los tubos les agregamos la suspensión de cloroplastos, y agitamos los tubos suavemente y no debemos olvidarnos de colocar el tubo 3’ en la oscuridad. A partir de este momento comenzamos a tomar el tiempo y observamos cuanto tarda en llegar al efecto acromático.
Por otro lado, hay otros ensayos que se pueden hacer sobre la preparación de cloroplastos, con el fin de analizar...
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