IBMC TP N1







INFORME DE LABORATORIO







Trabajo Práctico Nº1
“Extracción de DNA cromosómico de un pellet de E. Coli”



















Introducción
Las bacterias son organismos unicelulares cuya característica más llamativa a simple vista es no poseer compartimientos intracelulares diferenciados (Por ejemplo. Núcleo). La mayoría de las bacterias tienen un único cromosoma circular (de 160.000 a12.200.000 pares de bases según la especie de bacteria que se esté teniendo en cuenta). Además, suelen tener material genético extra cromosómico (plásmidos) que suele aportarles características que les permitan resistir a ciertos antibióticos.
Se denomina Gram Positivas a aquellas bacterias que se tiñen de color azul o violeta al introducir en solución un colorante. Este fenómeno está asociado a queeste subtipo de procariota tiene una pared celular ancha formada por péptidoglucano. Por otro lado, las Gram Negativas son aquellas que presentan dos paredes lipidicas entre las que se localiza una fina pared celular que no retiene el colorante, por ende no se tiñe.

Objetivo:
Extracción de DNA cromosómico de un pellet de E. Coli en 2 ml de buffer Tris HCl 50 mM (pH=8), sacarosa 25% (p/v)Materiales utilizados:
Bacterias de E. Coli. (resuspendidas en 2ml de buffer Tris-HCl 50mM, pH=8, sacarosa 25% (p/v)
Micropipeta P1000
EDTA 0,25 M pH=8 (ácido etilendiaminotetraacético)
Lisozima (10 mg/ml)
Varilla para revolver
Triton X-100 9% (v/v)
Acetato de Sodio 3M (pH=5,2)
Vaso de Precipitados
Pipeta 10ml
Etanol 90%
Etanol 70%
Soporte de telgopor
Propipeta


Procedimiento:
1) Disponemos,inicialmente, de un pellet bacterias de E. Coli resuspendidas en 2ml de buffer Tris-HCl 50mM, pH=8, sacarosa 25% (p/v). El buffer Tris-HCl, en el que se hallan las bacterias, sirve a modo de tampón que mantiene estable el pH de la solución. La finalidad de la sacarosa es lograr la plasmólisis de las bacterias, es decir, que se deshidraten. Esto sucede debido a que el medio externo de las bacterias eshipertónico, es decir, con mayor concentración de solutos, por lo que el agua dentro de las bacterias difunde por ósmosis hasta alcanzar el equilibrio entre el medio interno y el externo.










a es prca en que las00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000Tomamos el tubo de ensayos con las bacterias de E. Coli, previamente sumergido en hielo, y añadimos con unaP1000, 0,8ml de EDTA y mezclamos suavemente durante 10 minutos con una varilla a 0°C.
El EDTA, al ser un quelante de cationes Ca2+, logra detener la actividad enzimática de las DNasas (a 0°C) y extraer los cationes de la membrana externa de las bacterias desestabilizándola. La razón por la que se trabaja a 0ºC, en esta fase del protocolo, radica en que las DNasas tienen una actividad enzimáticaóptima a los 37ºC, mientras que a 0ºC la misma es prácticamente nula. (El pH del EDTA es de 8 para favorecer el trabajo de la lisozima que utilizaremos en el siguiente paso).

2) Agregamos con una P1000, 0,4 ml de lisozima y revolvemos suavemente con la varilla, luego dejamos reposar 10 minutos.
La lisozima utilizada, dada su actividad enzimatica, degrada el peptidoglicano de la pared celular de lasbacterias.











3) Retiramos la solución del hielo y comenzamos a trabajar a temperatura ambiente. Agregamos el Tritón X-100, mezclamos y dejamos reposar 30 minutos.












El Tritón agregado, al ser un detergente anfipático1, fomenta la formación de micelas de los fosfolípidos que integran la membrana bacterial. De este modo, este ractivo solubiliza los lípidos al formar micelas; lasproteínas que antes formaban parte de la membrana bacterial también se solubilizan, quedando fuera de las micelas. La desorganización de la membrana de la bacteria se traduce, finalmente, en la lisis de las mismas.

4) Agregamos 0,4ml de acetato de sodio, mezclamos con la varilla y transferimos a un vaso de precipitados.












La incorporación de cationes Na+ neutraliza las cargas...