Ibmc tp4

T.P. Nº 4
Actividad enzimática de la α-amilasa

Introducción.

La α-amilasa es una enzima que degrada almidón para formar azúcares simples. El almidón, reserva alimenticia predominante en las plantas, es un polisacárido constituido por dos tipos de moléculas, las cuales tienen como monómero a la glucosa:
-la amilasa, una cadena lineal y arrollada en forma helicoidal en la cual el C1 de unaglucosa está unido al C4 de la siguiente;
-la amilopectina, una cadena que, a diferencia de la amilasa, tiene ramificaciones (uniones C1 con C6).
La α-amilasa es una hidrolasa que actúa rompiendo la unión entre los carbonos 1 y 4 de dos glucosas, con la obtención de dextrinas (oligosacáridos compuestos por glucosa) como producto de la reacción.
Para determinar la actividad enzimática de laα-amilasa (velocidad de la reacción catalizada, factores que la afectan y mecanismos por los cuales ocurre) puede medirse:
 Cantidad de sustrato que desaparece en un tiempo determinado;
 Cantidad de producto que aparece en un tiempo determinado.

Objetivos.

Estudiar y caracterizar la actividad enzimática de la α-amilasa.

Materiales y métodos.

Se estudió la actividad enzimáticaobservando la cantidad de sustrato que desaparece por unidad de tiempo.

Detección de la desaparición del sustrato utilizando un test colorimétrico:

Se utilizó una solución de Lugol (1% de iodo diatómico en equilibrio con ioduro de potasio 2% en agua destilada), en la cual se aumenta la solubilidad del iodo, un elemento que interactúa con las moléculas de amilasa del almidón, con lo cual estepresenta una coloración azulada. Así, mientras la α-amilasa degrada el almidón, provocándole la pérdida de la propiedad de interactuar con iodo, este comienza a perder la coloración azulada.

Obtención de la dilución óptima de la α-amilasa salival y de los tiempos de referencia:

Se tomó como tiempo de referencia para que la enzima degrade completamente al almidón (efecto acromático) entre 1 y 8minutos, tiempo que se utilizará para evaluar el efecto de distintos tratamientos sobre la actividad enzimática. La dilución óptima es aquella en la cual, precisamente, el efecto acromático ocurre en este intervalo de tiempo.

Soluciones utilizadas:
-solución neutra de almidón 1%, 10ml
-solución de iodo (100ml de agua corriente+1ml de I2/IK) 0.01M, 5ml por tubo.

1) Se recolectó una muestra desaliva de 2 ml en un vaso de precipitado.
2) Se realizó una dilución de 1/5 de la saliva en un tubo de ensayo, se tapó el tubo con tapón de goma y se mezcló por inversión suavemente varias veces.
3) Se colocó un tubo de ensayo con 10 ml de solución neutra de almidón 1% en un baño térmico, a 37 ºC, durante al menos 2 minutos.
4) Se agregó al tubo con almidón (manteniéndolo en el baño térmico)1ml de saliva diluida, se tapó con tapón de goma y se mezcló por inversión. Se estableció este momento como t=0 (tiempo de comienzo de la reacción), por lo que se comenzó a cronometrar.
5) Se retiró del tubo en el que estaba ocurriendo la reacción, a t=0 y cada 30 segundos, 200μl y se agregó a sucesivamente a cada uno de los 10 tubos con la solución de iodo. Se mezcló por inversión.
6) Sedeterminó el tiempo en el cual ya no ocurría efecto acromático: 1’ 30” (en el caso de no estar este tiempo en el rango del tiempo de referencia prefijado, se deben hacer las diluciones necesarias hasta alcanzar la dilución óptima).

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN DISTINTAS CONDICIONES DE ENSAYO:

 PH ácido y alcalino:
Se realizaron nuevamente los pasos seguidos en la obtención de ladilución óptima, pero utilizando:
a) solución de almidón 1% pH 2;
b) solución de almidón 1% pH 12.
Se determinó en cada caso el tiempo necesario para que ocurra el efecto acromático.

 0ºC y 70ºC:
Se llevó a cabo el mismo procedimiento que en la obtención de la dilución óptima, pero incubando en baño térmico a:
a) 0ºC;
b) 70ºC.
Se determinó en cada caso el tiempo necesario para que ocurra el...