Identificacion de mycoplasma

RESUMEN
El objetivo del presente trabajo fue evaluar diferentes métodos de extracción de ADN de micoplasmas, para su empleo en el diagnóstico por PCR. La caracterización de la cepa de Mycoplasma arginini utilizada como control positivo, se realizó con el empleo de los estudios morfológicos y las pruebas bioquímicas y enzimáticas. A continuación se procedió a la obtención de un cultivo homogéneode la cepa de Mycoplasma arginini, que permitiera evaluar tres métodos de extracción de ADN de micoplasmas para su utilización en el ensayo de PCR. Se probaron los métodos de extracción fenol - cloroformo, centrifugación y centrifugación con choque térmico en muestras clínicas de cultivos celulares, sueros y productos biofarmacéuticos, que habían sido testadas por el método de cultivo y laHibridación de Ácidos Nucleicos (HAN). Como resultado se obtuvo la cepa de Mycoplasma arginini caracterizada y evaluada. Tanto el método de fenol-cloroformo, como la centrifugación y centrifugación con choque térmico, más sencillos, brindaron similares resultados cuando se realizó la PCR utilizando la cepa tipo de Mycoplasma arginini. Se demostró que los métodos de choque térmico y centrifugación soneficientes para la obtención de ADN de micoplasmas a partir de muestras clínicas con el empleo de la PCR, comparándose estos resultados con los obtenidos por cultivo y la HAN.
Palabras clave: micoplasmas; diagnóstico; cultivos celulares; PCR
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ABSTRACT
The aim of this work was to evaluate different DNA extraction methods of mycoplasma with the use of PCR.The characterization of Mycoplasma arginini strain use as positive control in this test was carried out, by means of morphological studies and biochemical and enzymatic tests, in order to obtain a homogenous culture, which allowed evaluating three mycoplasma DNA extraction methods for their use in the PCR test. Methods based on centrifuge and thermal shock with centrifuge were proven for the DNAextraction in cell culture clinical samples, sera and biopharmaceutical products, which had been tested by culture method and Nucleic Acid Hybridization (NAH). Mycoplasma arginini, strain was characterized and evaluated. Either phenol-chloroform extraction as well as two more simple methods describe above, brought the same results when the PCR assay was carried out usingM. arginini strain. It hasbeen demonstrated that the methods based on centrifuge and thermal shock with centrifuge are efficient to obtain Mycoplasma DNA from clinical samples with the use of PCR, comparing these results with those obtained by culture method and NAH.
Key words: mycoplasmas; diagnostic; cell cultures; PCR
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INTRODUCCIÓN
La necesidad de controlar estrictamente lascontaminaciones por micoplasmas en cultivos celulares, sueros y productos biofarmacéuticos de aplicación biomédica, está basada en los efectos indeseables que producen estos microorganismos en los cultivos celulares infectados, así como en el individuo que recibe estos productos contaminados (1). Debido a esto las agencias reguladoras han establecido normas muy estrictas relacionadas con ladetección de contaminaciones y entre ellas, específicamente, la detección de micoplasmas (2; 3).
Numerosos métodos se han utilizado para lograr el aislamiento, detección e identificación de los micoplasmas: los cultivos microbiológicos, las pruebas bioquímicas y enzimáticas, tinción fluorescente del ADN y las técnicas moleculares dentro de las que se encuentran la Hibridación de ácidos nucleicos (HAN) yla Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (4).
Los micoplasmas como característica distintiva carecen de pared celular, lo cual ha permitido desarrollar diferentes métodos de extracción de ADN mucho más sencillos, basados en choques térmicos o ruptura mecánica, para ser empleados en los ensayos de PCR, además de tener en cuenta las grandes ventajas que presenta esta técnica como son su gran...