Inducción enzimática (uba)

TRABAJO PRÁCTICO N° 5
Inducción enzimática

Objetivo: Observar si el operón lactosa es inducido en un número de casos distintos, modificando en cada uno las condiciones del medio de cultivo.

Procedimiento:

Tubo n° |1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |8 | |Cultivo |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |  | |Solución fisiológica |0,5 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,3 |0,2 |0,5 | |IPTG (40 mM) |  |0,1 |  |  |  |  | |  | |Lactosa (5%) |  |  |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 | |Cloranfenicol (30 mg/ml) |  |  |  |  |0,1 |  |  |  | |Glucosa (10%) |  |  |  |  |  |0,1 |0,1 |  | |AMPc (5 nM) |  |  |  |  |  |  |0,1 |  | |Buffer Z |0,6 |0,6 |0,6 |0,6 |0,6 |0,6 |0,6 |0,6 | |SDS 0,1% |1 gota |1 gota |1 gota |  |1 gota |1 gota |1 gota |1 gota | |Cl3CH |4 gotas |4 gotas |4 gotas |  |4 gotas |4 gotas |4 gotas |4 gotas | |ONPG|0,25 |0,25 |0,25 |0,25 |0,25 |0,25 |0,25 |0,25 | |Na2CO3 5% |0,5 |0,5 |0,5 |0,5 |0,5 |0,5 |0,5 |0,5 | |Todos los volúmenes están especificados en ml

Interpretación general:

• El cultivo original no contenía glucosa ni lactosa, pues de lo contrario el operón ya empezaría a actuar y no podríamos verificar si es inducido posteriormente.
• El cloranfenicol es un antibiótico que inhibe lasíntesis proteica.
• La glucosa inhibe la formación de AMPc, pero al agregar aparte AMPc deberíamos ver actividad.
• La solución fisiológica es utilizada como buffer y como equiparador de volúmenes entre los distintos tubos.
• El SDS permea la célula y permite el contacto entre la enzima y la lactosa. El cloroformo lisa las células y también permite que entre la lactosa. De esta manera esposible la interacción enzima-sustrato. En cambio, en el tubo 4 la bacteria está viva y la lactosa no puede entrar a la célula pues su membrana está intacta, con lo que no se verá actividad enzimática. También hay que destacar que la cantidad de SDS fue suficiente para degradar la membrana pero no para desnaturalizar la enzima a medir.
• El buffer Z pH 7 al tener β-mercaptoetanol funciona como agentereductor, es decir rompe los puentes disulfuro de la (- galactosidasa para que ésta pueda funcionar In Vitro
• El OPNG actúa como sustrato de la enzima β -galactosidasa, que lo degrada y da como producto el orto-nitrofenol, que es de color amarillo. Entonces en esta experiencia comprobaremos si hay actividad enzimática a partir de la aparición de producto.
• El Na2CO3 detiene la reacción,sino terminaría por degradarse todo y no se podrían apreciar los resultados.

• Resultados:

A cada tubo de la gradilla se le asigno un número relativo por intensidad de color amarillo:

[pic]
Grafico 1: Histograma de barras de intensidad de color en cada tubo después de hacerse el proceso antes mencionado para todos los tubos.

Conclusión

El color amarillo de los tubos evidenció laactividad de la β-galactosidasa (enzima del operon-Lac) ya que ésta hidrolizó ONPG agregado a los tubos luego de la previa traducción de la enzima en la incubación.

Tubo 1: Solo poseía bacterias, se observó nivel basal de actividad de β-gal. Este tubo sirvió de control para saber cuanta actividad hay en una célula sin inducciones.

Tubo 2: Se observó mucha actividad de β-gal, porque este tubocontenía el cultivo de bacterias e IPTG, que es un buen inductor positivo para la enzima, o sea, se pega al represor y este no tiene mas afinidad por el ADN.

Tubo 3: Se percibió mucha actividad de la β-gal pero menos que en el tubo anterior, de esto se deduce que la Lactosa es un buen inductor. No se puede saber si es más o menos efectivo como inductor que el IPTG, pues en la experiencia no se losutilizó en la misma concentración. La lactosa activa la expresión del operón-Lac.

Tubo 4: No se observó actividad de β-gal por más que se utilizaran las mismas sustancias que en el tubo 3 ya que este tubo no tenia SDS ni Cl3CH, esto implicó que las células no se lisaran. Se determinó que ni la lactosa ni el OPNG (sustratos) logran entrar a la célula pues su membrana todavía está intacta;...