Inducción Enzimática

TRABAJO PRÁCTICO Nº 5

Inducción enzimática.



AUTORES

N° GRUPO

8 (ocho)

TURNO

10 (diez) Viernes 18-22hs



INTRODUCCIÓN

El sistema de control de la expresión génica regulado por el aprovechamiento de la lactosa como fuente de energía se denomina operón lac. Este consta de tres genes conectados: lacZ, lacY y lacA que codifican respectivamente para las proteínasgalactósido-permeasa (permite el ingreso de lactosa a la célula); β-galactosidasa (hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa); y tiogalactósido-transacetilasa, que parece no cumplir ninguna función en esta vía metabólica. Para estos tres genes existe un único promotor, por lo que se transcriben en un solo mRNA policistrónico.
Este sistema también incluye un gen de expresión constitutiva, llamado lacI,cuyo producto proteico inhibe la transcripción de los genes lacZ, lacY y lacA al unirse al operador (región de DNA solapada con el promotor y el inicio del gen lacZ). La proteína codificada por el gen lacI es llamada represor. Este posee una estructura tetramérica, que en cada subunidad alberga un sitio de unión para una molécula denominada inductor, que en este caso es la alolactosa, un derivado dela lactosa, aunque también existen inductores denominados “gratuitos” (en este caso se utilizó IPTG) que sirven como inductores de los genes, pero no son sustrato de las proteínas que producen, por lo que no se degradan, y pueden seguir contribuyendo a la expresión de los genes. Cuando el inductor se une al represor, este pierde afinidad por el DNA, dejando al operador libre, por lo que se puedeunir la RNA polimerasa y permite el inicio de la transcripción. A este tipo de control se lo llama “control negativo”.
De todas maneras, esta represión no es 100% efectiva, ya que el represor puede despegarse del operador aún en ausencia del inductor, lo que implica que aunque no haya inducción puede haber transcripción. A este mecanismo se lo llama síntesis de escape.
Contrariamente, tambén seproduce un control positivo, ejercido por moléculas activadoras, en este caso se trata de la proteína CRP, que tiene un sitio de unión para el AMP cíclico (cAMP) y otro al DNA. El complejo CRP-cAMP se une a un sitio específico del promotor, haciéndolo más afín a la RNA polimerasa, de esta forma, se favorece la transcripción de los genes estructurales.
Se dice, entonces, que hay inducción en unsistema cuando el represor no actúa sobre el operador debido a la presencia del inductor, o cuando el complejo CRP-ligando actúa sobre el promotor.

Al poder utilizar dos fuentes de carbono para obtener energía, y por sus mecanismos de regulación, la curva de crecimiento de las bacterias muestra tres zonas distinguidas: una en que se ve un crecimiento exponencial de la población; la segunda, querefleja lo que dura el tiempo de adaptación al nuevo medio (solamente conteniendo lactosa), es decir, la inducción; y la tercera, en que, al ya haber glucosa presente en el medio, se repite el mismo patrón que en la primera. A este fenómeno se lo llamó diauxia.

OBJETIVO

• Estudiar las condiciones de inducción del operón lactosa, y en base a esos resultados reconstruir el mecanismo deregulación del operón por control positivo y negativo.



DESARROLLO

El experimento consta de dos partes, la primera in vivo, y la segunda in vitro.
La primera parte consta de la incubación de las bacterias con diferentes soluciones que podrían regular la expresión del operón lac.
Se partió de 1ml de una cepa de E. coli, que se colocó en diferentes tubos, conteniendo diferentes soluciones,según la siguiente tabla:

[pic]
Tabla 1: Tabla de soluciones a introducir en cada tubo. Todos los valores se especifican en ml. (*) La lactosa se introducirá en el tubo nº9 luego de incubar a 37ºC durante 30 minutos.

Se mezclaron las soluciones por inversión y se las colocó en un baño termostático a 37ºC durante 30 minutos. Luego se agregaron 0,6 ml de buffer Z [NO SE PARA QUÉ SIRVE] a...