Informe 2 Inmuno 1





INFORME DE INMUNOLOGÍA VETERINARIA
“AISLAMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES EN SANGRE PERIFÉRICA”
Curso: Inmunología Veterinaria
Grupo 2

Integrantes:
Víctor Aquino (Introducción)
Víctor Marín (Metodología)
Maite Castillo (Objetivo)
Brigitte Osorio (Resultados y discusión)
Fiorella Zúñiga (Conclusiones)



Lima – Perú
30/03/15

Introducción
Las Células mononucleares de sangreperiférica (PBMC) se caracterizan por tener solo 1 núcleo, tales como los linfocitos o monocitos. Los cuales son componentes claves del sistema inmune en su lucha constante contra infecciones.
El aislamiento y estudio de propiedades en las PBMC tiene múltiples usos en el campo médico y en la Investigación del VIH, debido a que dentro del grupo de las PBMC también hayamos a los Linfocitos T4, loscuales se ven afectados por este virus.
Conociendo ello es posible realizar el aislamiento para el respectivo análisis de sus propiedades. Este aislamiento se obtiene por medio de una centrifugación de sangre periférica (antebrazo), en una gradiente de densidad a causa de polímeros polisacáridos (Histopaque). Luego de la centrifugación se nos es posible obtener una capa líquida de PBMC separadas, deeritrocitos y neutrófilos principalmente.
En esa interface que se obtuvo por la centrifugación se obtienen linfocito B, linfocitos T, células NK, células dendríticas y monocitos.
Objetivos
El objetivo general de la práctica fue aislar células mononucleares para posteriormente realizar el conteo mediante el uso de la cámara de Neubauer. También compararemos el número de células viables y no viablesluego del descongelado y de una muestra fresca. Centrifugaremos y se separaremos por gradiente de densidad con el uso del Histopaque. Mediante el desarrollo de la práctica también se reforzaría el conocimiento sobre los componentes sanguíneos y las células del sistema inmune que se encuentran.
Metodología
1. Trasladar la muestra de sangre hacia un Tubo falcon y añadir el mismo volumen de suerofisiológico.
2. En otro tubo falcon de 15 ml adicionar 1/3 de Histopaque.
3. Posteriormente adicionar lentamente y de manera inclinada el tubo, 2/3 de la sangre diluida anteriormente sobre el Histopaque.
4. Realizar el centrifugado a 1400 rpm sin freno durante un tiempo de 30 minutos.
5. Recuperar el anillo de células blancas (Buffy Coat) y transferirlos a otro tubo Falcon.
6. Llevar a 15 ml consuero fisiológico.
7. Realizar el centrifugado a 900 rpm durante un tiempo de 10 minutos (primera vez)
8. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 15 ml de PBS o suero fisiológico.






En la presente figura se observan los estratos formados después de la centrifugación con Histopaque.
9. Para realizar el congelamiento de las PBMC:

Centrifugar a 1400 rpm durante un tiempo de 5minutos.
Aspirar el sobrenadante, a partir de este momento trabajar sobre hielo.
Resuspender el pellet con 1 ml de DMSO.
Transferir las células hacia un criovial.
Congelar el sistema Mr. Frost.

10. Para realizar el descongelamiento de las PBMC:

Retirar las células del descongelador.
En un tubo Falcon de 15 ml adicionar 10 ml de RPMI
Adicionar alícuotas del medio sobre el tubo conteniendo las célulascongeladas y recuperar la parte líquida. Repetir este procedimiento hasta alcanzar a transferir todo en el tubo Falcon de 15 ml.
Realizar el centrifugado a 1400 rpm durante un tiempo de 5 minutos.
Aspirar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de RPMI

11. Diluir 2X en azul de Tripán, para poder diferenciar las células vivas de las muertas.
12. Realizar el conteo de células viables y muertas enuna cámara neubauer.

Resultados:
Al finalizar el conteo de las células de la muestra obtenida, se obtuvieron los siguientes resultados:
Número de células viables: 0
Número de células inviables: 252
Porcentaje de células viables: 0%
Promedio de células por cuadrante: 0
Factor de dilución: 1000uL / 500uL = 2
Concentración: 0
La razón por la cual se obtuvo un 0% de células viables fue debido a la...