Informe 4 Tp6
Páginas: 10 (2256 palabras)
Publicado: 1 de julio de 2015
Trabajo Práctico 6
Inducción Enzimática
Grupo Nº 5
Integrantes: Martín Iungman, Facundo Chavarría Schpaliansky y
Vladimir Nicolás Barrios
Introducción:
En todos los organismos es importante mantener un equilibrio en cuanto al
aprovechamiento de distintos componentes dentro de la célula. La función de mantener este equilibrio está generalmente atribuida a enzimas, por lo cual es importante el control de su
síntesis. Otras formas de regulación son la modulación de una proteína ya sintetizada, o la
regulación de la síntesis de varias proteínas involucradas en un mismo proceso metabólico.
El fin de estas regulaciones suele estar asociado al ahorro de energía, razón por la cual el
inicio de la transcripción es el tipo de regulación más abundante. Los primeros estudios acerca de la regulación de la expresión génica se hicieron en
bacterias de E. Coli. En un estudio se pudo observar que al darle a la bacteria 2 fuentes de
carbono diferentes, la bacteria consumía primero una en su totalidad, y luego la otra. Este
fenómeno fue llamado diauxia. Más adelante se dedujo el mecanismo molecular del proceso
regulatorio que llevaba a cabo la bacteria para realizar este proceso.
Para regular el aprovechamiento de la lactosa como fuente de energía existe un método
común en procariotas que consta de tres genes conectados (lacY, lacZ y lacA, llamados
genes estructurales), con un único promotor, y que codifica para un mRNA policistrónico
que se traduce en 3 proteínas diferentes, 2 de ellos relacionadas con el metabolismo de la
lactosa. Este sistema también incluye un gen ubicado cerca de los tres genes estructurales llamado
lacI, del cual se obtiene un producto proteico que se une a una región del DNA ubicada
entre el gen lacZ y el promotor, reprimiendo la transcripción de los genes estructurales. Esta
proteína fue llamada ‘’represor’’ y el segmento de DNA al que se une la proteína fue llamado ‘’operador’’. En el caso de la regulación de la lactosa, la proteína represora es llamada
‘alolactosa’.
Cada unidad del represor posee un sitio de unión a otra molécula llamada ‘’inductor’’.
Cuando el inductor se une al represor forma un complejo sin afinidad por el DNA, lo que
hace que se desprenda del operador y permitiendo la transcripción de los genes
estructurales. Esta molécula inductora es la alocactosa. Este control ejercido por un
represor es llamado ‘’control negativo’’. Otro elemento incluido en este sistema está´constituido por una proteína llamada CRP,
que tiene un sitio de unión al AMPc (AMP cíclico) y otro sitio de unión al DNA. El complejo
que forma el CRP unido al AMPc se une a un sitio del promotor que lo hace afín por la
RNApol, favoreciendo la transcripción de los genes estructurales. La proteína CRP se denomina ‘’activador’’, y el tipo de control ejercido por un activador es llamado ‘’control
positivo’’.
Si los genes estructurales se transcriben, se dice que hay ‘’inducción’’ del sistema, y este
sistema de control de la expresión génica se denomina ‘’operón lactosa’’.
Objetivo:
Estudiar las condiciones de inducción, represión y activación del operón
lac.
Desarrollo: Rotular 8 tubos eppendorf e insertarles con una micropipeta los distintos compuestos
expresados en ml. siguiendo el protocolo representado en la siguiente tabla:
Tubo Nº
1
2
Cultivo
0,1 ml. 0,1 ml.
3
4
5
6
7
8
0,1 ml. 0,1 ml.
0,1 ml.
0,1 ml.
0,1 ml.
Solución 0,5 ml. 0,4 ml.
fisiológica
0,4 ml. 0,4 ml.
0,4 ml.
0,3 ml.
0,5 ml.
0,4 ml.
IPTG
(40mM)
0,1 ml.
Lactosa
(5%
0,1 ml. 0,1 ml.
0,1 ml. 0,1 ml.
0,1 ml.
Cloranfen
icol (30
mg/ml)
0,01
ml.
Glucosa
(10%)
0,1 ml.
Taparlos y mezclar por inversión.
Colocarlos en un baño de 37ºC por 30 min, agitando periódicamente
Agregar 0,6 ml de buffer Z pH 7 en todos los tubos ...
Inducción Enzimática
Grupo Nº 5
Integrantes: Martín Iungman, Facundo Chavarría Schpaliansky y
Vladimir Nicolás Barrios
Introducción:
En todos los organismos es importante mantener un equilibrio en cuanto al
aprovechamiento de distintos componentes dentro de la célula. La función de mantener este equilibrio está generalmente atribuida a enzimas, por lo cual es importante el control de su
síntesis. Otras formas de regulación son la modulación de una proteína ya sintetizada, o la
regulación de la síntesis de varias proteínas involucradas en un mismo proceso metabólico.
El fin de estas regulaciones suele estar asociado al ahorro de energía, razón por la cual el
inicio de la transcripción es el tipo de regulación más abundante. Los primeros estudios acerca de la regulación de la expresión génica se hicieron en
bacterias de E. Coli. En un estudio se pudo observar que al darle a la bacteria 2 fuentes de
carbono diferentes, la bacteria consumía primero una en su totalidad, y luego la otra. Este
fenómeno fue llamado diauxia. Más adelante se dedujo el mecanismo molecular del proceso
regulatorio que llevaba a cabo la bacteria para realizar este proceso.
Para regular el aprovechamiento de la lactosa como fuente de energía existe un método
común en procariotas que consta de tres genes conectados (lacY, lacZ y lacA, llamados
genes estructurales), con un único promotor, y que codifica para un mRNA policistrónico
que se traduce en 3 proteínas diferentes, 2 de ellos relacionadas con el metabolismo de la
lactosa. Este sistema también incluye un gen ubicado cerca de los tres genes estructurales llamado
lacI, del cual se obtiene un producto proteico que se une a una región del DNA ubicada
entre el gen lacZ y el promotor, reprimiendo la transcripción de los genes estructurales. Esta
proteína fue llamada ‘’represor’’ y el segmento de DNA al que se une la proteína fue llamado ‘’operador’’. En el caso de la regulación de la lactosa, la proteína represora es llamada
‘alolactosa’.
Cada unidad del represor posee un sitio de unión a otra molécula llamada ‘’inductor’’.
Cuando el inductor se une al represor forma un complejo sin afinidad por el DNA, lo que
hace que se desprenda del operador y permitiendo la transcripción de los genes
estructurales. Esta molécula inductora es la alocactosa. Este control ejercido por un
represor es llamado ‘’control negativo’’. Otro elemento incluido en este sistema está´constituido por una proteína llamada CRP,
que tiene un sitio de unión al AMPc (AMP cíclico) y otro sitio de unión al DNA. El complejo
que forma el CRP unido al AMPc se une a un sitio del promotor que lo hace afín por la
RNApol, favoreciendo la transcripción de los genes estructurales. La proteína CRP se denomina ‘’activador’’, y el tipo de control ejercido por un activador es llamado ‘’control
positivo’’.
Si los genes estructurales se transcriben, se dice que hay ‘’inducción’’ del sistema, y este
sistema de control de la expresión génica se denomina ‘’operón lactosa’’.
Objetivo:
Estudiar las condiciones de inducción, represión y activación del operón
lac.
Desarrollo: Rotular 8 tubos eppendorf e insertarles con una micropipeta los distintos compuestos
expresados en ml. siguiendo el protocolo representado en la siguiente tabla:
Tubo Nº
1
2
Cultivo
0,1 ml. 0,1 ml.
3
4
5
6
7
8
0,1 ml. 0,1 ml.
0,1 ml.
0,1 ml.
0,1 ml.
Solución 0,5 ml. 0,4 ml.
fisiológica
0,4 ml. 0,4 ml.
0,4 ml.
0,3 ml.
0,5 ml.
0,4 ml.
IPTG
(40mM)
0,1 ml.
Lactosa
(5%
0,1 ml. 0,1 ml.
0,1 ml. 0,1 ml.
0,1 ml.
Cloranfen
icol (30
mg/ml)
0,01
ml.
Glucosa
(10%)
0,1 ml.
Taparlos y mezclar por inversión.
Colocarlos en un baño de 37ºC por 30 min, agitando periódicamente
Agregar 0,6 ml de buffer Z pH 7 en todos los tubos ...
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