Informe anexinas





Expresión y purificación de la anexina A5 recombinante de pollo

METODOLOGÍA Y EXPERIMENTACIÓN BIOQUÍMICAS III
CURSO 2010-2011
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID



















Índice Página
Índice Página 2
INTRODUCCIÓN 3
CLASIFICACIÓN 3
ESTRUCTURA 3
LA ANEXINA A5 4
OBJETIVOS 5
MATERIALES Y MÉTODOS 5
PURIFICACIÓN DELPLÁSMIDO RECOMBINANTE 5
ESTUDIOS DE EXPRESIÓN 6
PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE 6
RESULTADOS 8
PURIFICACIÓN DEL PLÁSMIDO RECOMBINANTE 8
ESTUDIOS DE EXPRESIÓN 10
PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE 12
DISCUSIÓN 17
PURIFICACIÓN DEL PLÁSMIDO RECOMBINANTE 17
ESTUDIOS DE EXPRESIÓN 19
PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE 21
BIBLIOGRAFÍA 22ANEXOS………………………………………………………………………………………………………………………………………...23














INTRODUCCIÓN
Las anexinas son una familia de proteínas de membrana con diversas estructuras. Todas ellas se unen a membranas biológicas. Se ha observado que estas proteínas pueden regular, in vivo, ciertos procesos tales como el tráfico de membrana, la respuesta del Ca2+o algunos eventos extracelulares [1]
La unión a las membranas normalmente es dependiente de Ca2+, aunque existen algunas excepciones en las quela unión a membranas es independiente de este ión. En general, estas proteínas son citosólicas y se encuentran unidas a membrana, son muy abundantes y ubicuas.
Las anexinas poseen un sitio de unión a Ca2+ tipo II y se unen a las membranas interaccionando con la fosfolípidos. Este sitio de unión es diferente al de otras proteínas que ligan Ca2+.
CLASIFICACIÓN
Las anexinas pueden clasificarse enfunción del organismo en el que se encuentren. De esta manera tenemos:
Anexinas A: que se encuentran en animales superiores
Anexinas B: que son las que se encuentran en invertebrados
Anexinas C: las que poseen los hongos. Estas poseen un extremo N-terminal largo
Anexinas D: las que se encuentran en plantas. En estas anexinas, la unión a membrana suele ser independiente de Ca2+
Anexinas E: enprotozoos. Presentan diferencias en su extremo N-terminal.
ESTRUCTURA
En las anexinas se pueden distinguir dos dominios estructurales:
Por un lado, tendríamos el dominio conservado (o núcleo). Es el dominio en el que se encuentra el extremo C-terminal de la proteína. En este dominio se encuentran los sitios ligantes de Ca2+ (tipo II y tipo III) y las zonas de interacción con las membranas.Compuesto por cuatro segmentos que forman estructuras en α-hélice. Los segmentos se encuentran compactados dando una cierta curvatura. En el lado convexo encontramos el sitio de unión a Ca2+tipo II y III y por esta cara es por la que la anexina realiza su interacción con la membrana. Por otra parte tenemos el lado más cóncavo, que parece ser, interacciona con el extremo N-terminal de la proteína y,posiblemente con otros componentes citoplasmáticos de las células.[2]
En el otro lado tenemos el extremo N-Terminal. Mas variable entre unas anexinas y otras, se encuentra situado en el lado opuesto al de la interacción entre las anexinas y los fosfolípidos de membrana. Los dominios N-terminales de las anexinas difieren tanto en longitud como en secuencia, de esta manera podemos encontrar tresgrupos de anexinas en función de la longitud de este dominio:
Proteínas con dominio N-terminal corto: son anexinas que poseen un dominio N terminal que contiene unos 20-21 aminoácidos. En este grupo está incluida la anexina objeto de este estudio, la anexina A5
Proteínas con dominio N-terminal medio: de unos 55 aminoácidos
Proteínas con dominio N-terminal largo: de más de 100 aminoácidos.
Estaclasificación no implica semejanzas o diferencias en cuanto a la función de las anexinas, pero es útil para comparar las características estructurales de este dominio entre diferentes anexinas[3]
LA ANEXINA A5
La anexina A5 es una de las proteína de esta familia que tiene tanto presencia intra como extracelular en las...