Informe Biologia Adn
Páginas: 6 (1279 palabras)
Publicado: 19 de noviembre de 2012
Título de la Práctica: “Extracción de ADN y electroforesis”
Objetivos alcanzados:
* Realizar la extracción de ADN de una muestra origen vegetal siguiendo el procedimiento planteado para obtener una muestra con alto peso molecular.
* Utilizar la electroforesis como medio de análisis para la verificación de la concentración e integridad del ADN obtenido.
* Valorar el porcentaje depureza por medio de la medida de absorbancia de la muestra en ciertas longitudes de onda donde absorben las proteínas y el ADN
Resultados:
1. Muestra de arveja macerada con adicion de solución buffer 1 ( 50 mM Tris –HCl (pH 8.0, 5 mM EDTA. 350 mM Sorbitol, 0.1% Mercaptoetanol, 10% polyetilenglicol)
Se utilizo el macerar la muestra para lograr el rompimiento de las membranas y asípoder proceder a la limpieza del material presente, es por esto que se utiliza la solución buffer #1 que tratara de mantener el pH que tiene la célula, un agente quelante que su función es atrapar los iones de Magnesio mediante la formación de complejos y una sustancia antioxidante para mantener los enlaces y la estructura. La muestra queda precipitada y se lleva a centrifugación para realizaruna buena limpieza.
2. Muestra con solución buffer# 2 ( 50mM Tris – HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 350 mM Sorbitol, 0.1 % Mercaptoetanol, 1% Sodio Sarkosyl, 710 mM NaCl, 0.1 % Centiltrimetilamonio (CTAB))
Se hace un nuevo lavado con la solución buffer # 2 utilizando el NaCl como agente limpiador, es STB es un detergente catiónico que permite homogenizar el medio, facilitando la miscibilidad defases y reduciendo la tensión superficial.
La muestra sigue precipitada y presenta una coloración verde además aun no se ha terminado de extraer completamente el ADN.
3. Muestra con adición de Cloroformo y Alcohol Isoamílico en proporción 24:1
Se busca que el ADN se solubilice para poder ser retirado de manera más fácil, además se da la utilización del cloroformo para ladesnaturalización y se de la separación de las proteínas y del ADN y el alcohol sirve para precipitar nuevamente al ADN.
4. Muestra con adición de Isopropanol
Se utiliza para terminar de re suspender el ADN precipitado y asi poder retirarlo para hacerle otro lavado.
5. Muestra con adición de etanol al 70% luego de centrifugación.
La adición del etanol termina de limpiar y precipita el ADN.
6.Muestra con la última adición de la solución buffer #1
Con esta adición se busca terminar de disolver el ADN libre de proteínas y material celuloso para proceder a su lectura en el espectrofotómetro de absorción, además se debió agitar ya que nuestra muestra se encontraba en estado semi solido.
Para hacer la cuantificación del ADN se le hizo una lectura en el espectrofotómetro de absorción alos 260 nm y así conocer que tan purificada esta la muestra.
* A los 260 nm nuestra muestra dio 1.181 de absorbancia y a los 280 nm índico una absorbancia de 1.014. La relación de buena purificación está dada por:
Absorbancia ADN = > 1.8 1.181 = 1.16 Por lo que concluimos que nuestra muestra
Absorbancia proteínas 1.014 presenta contaminación.* Al realizar la electroforesis y comparar el desplazamiento de la muestra patrón en el gel de agarosa con nuestra muestra, hubo una distancia recorrida por esta que llego entre los 3000 y 2000 pares de bases indicándonos que es una muestra con alto peso molecular.
Análisis de resultados:
La electroforesis es la técnica que consiste en separar las moléculas que están en contacto con otrasa través de una matriz tamponada, esta matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleícos es el grupo fosfatos presente en ellos el que hará que se pueda dar el intercambio iónico y así por la vibración se dará el desplazamiento, a mayor peso molecular será más difícil que se den...
Objetivos alcanzados:
* Realizar la extracción de ADN de una muestra origen vegetal siguiendo el procedimiento planteado para obtener una muestra con alto peso molecular.
* Utilizar la electroforesis como medio de análisis para la verificación de la concentración e integridad del ADN obtenido.
* Valorar el porcentaje depureza por medio de la medida de absorbancia de la muestra en ciertas longitudes de onda donde absorben las proteínas y el ADN
Resultados:
1. Muestra de arveja macerada con adicion de solución buffer 1 ( 50 mM Tris –HCl (pH 8.0, 5 mM EDTA. 350 mM Sorbitol, 0.1% Mercaptoetanol, 10% polyetilenglicol)
Se utilizo el macerar la muestra para lograr el rompimiento de las membranas y asípoder proceder a la limpieza del material presente, es por esto que se utiliza la solución buffer #1 que tratara de mantener el pH que tiene la célula, un agente quelante que su función es atrapar los iones de Magnesio mediante la formación de complejos y una sustancia antioxidante para mantener los enlaces y la estructura. La muestra queda precipitada y se lleva a centrifugación para realizaruna buena limpieza.
2. Muestra con solución buffer# 2 ( 50mM Tris – HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 350 mM Sorbitol, 0.1 % Mercaptoetanol, 1% Sodio Sarkosyl, 710 mM NaCl, 0.1 % Centiltrimetilamonio (CTAB))
Se hace un nuevo lavado con la solución buffer # 2 utilizando el NaCl como agente limpiador, es STB es un detergente catiónico que permite homogenizar el medio, facilitando la miscibilidad defases y reduciendo la tensión superficial.
La muestra sigue precipitada y presenta una coloración verde además aun no se ha terminado de extraer completamente el ADN.
3. Muestra con adición de Cloroformo y Alcohol Isoamílico en proporción 24:1
Se busca que el ADN se solubilice para poder ser retirado de manera más fácil, además se da la utilización del cloroformo para ladesnaturalización y se de la separación de las proteínas y del ADN y el alcohol sirve para precipitar nuevamente al ADN.
4. Muestra con adición de Isopropanol
Se utiliza para terminar de re suspender el ADN precipitado y asi poder retirarlo para hacerle otro lavado.
5. Muestra con adición de etanol al 70% luego de centrifugación.
La adición del etanol termina de limpiar y precipita el ADN.
6.Muestra con la última adición de la solución buffer #1
Con esta adición se busca terminar de disolver el ADN libre de proteínas y material celuloso para proceder a su lectura en el espectrofotómetro de absorción, además se debió agitar ya que nuestra muestra se encontraba en estado semi solido.
Para hacer la cuantificación del ADN se le hizo una lectura en el espectrofotómetro de absorción alos 260 nm y así conocer que tan purificada esta la muestra.
* A los 260 nm nuestra muestra dio 1.181 de absorbancia y a los 280 nm índico una absorbancia de 1.014. La relación de buena purificación está dada por:
Absorbancia ADN = > 1.8 1.181 = 1.16 Por lo que concluimos que nuestra muestra
Absorbancia proteínas 1.014 presenta contaminación.* Al realizar la electroforesis y comparar el desplazamiento de la muestra patrón en el gel de agarosa con nuestra muestra, hubo una distancia recorrida por esta que llego entre los 3000 y 2000 pares de bases indicándonos que es una muestra con alto peso molecular.
Análisis de resultados:
La electroforesis es la técnica que consiste en separar las moléculas que están en contacto con otrasa través de una matriz tamponada, esta matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleícos es el grupo fosfatos presente en ellos el que hará que se pueda dar el intercambio iónico y así por la vibración se dará el desplazamiento, a mayor peso molecular será más difícil que se den...
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