INFORME BIOLOGIA MOLECULAR

UNIVERSIDAD NACIONAL
“PEDRO RUIZ GALLO”
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

INFORME DE PRÁCTICAS
Laboratorio de Genética y Biología M o l e c u l a r
METODO DE EXTRACCION DE ADN
“Protocolo CTAB”
INTEGRANTES:
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Acosta Quiroz Johana
Bustamante Cabrera Gianmarco
Cabrejos Ramírez Denner
Flores Santos Aldemir
Ramos Marrufo Jonathan
Saavedra Camacho Johnny
Sipión Díaz Sandra
Suyón JiménezJank Pierr
Verástegui Gaona Carmen

DOCENTE:
Rodríguez Delfín Luis

LAMBAYEQUE, JUNIO 2015

METODO DE EXTRACCION DE ADN “PROTOCOLO CTAB”

PRACTICA Nº 02:
METODO DE EXTRACCION DE ADN “Protocolo CTAB”
Objetivos
 Utilizar un protocolo de extracción de ADN estandarizado.
 Realizar cálculos químicos para la elaboración de un Buffer de lisis.
 Obtener la precipitación y resuspencion del ADN.Materiales
 Muestra: Hígado de Pollo
 Mortero estéril
 2 vasos de precipitación 100 ml
 Tubos Eppendorf de 1.5 ml
 Bagueta de vidrio
 Microcentrifuga
 Agua destilada
 NaCl
 CTAB
 Sal EDTA
 Sal TRIS-HCL pH 8.0
 β – Mercaptoetanol
 Fenol-Cloroformo-Alcohol isoamilico
 Isopropanol Helado
 Etanol 70% + T.E.
 Solución T.E. 20:5

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METODO DE EXTRACCION DE ADN “PROTOCOLO CTAB”Procedimiento
1. Preparar una solución de lisis o Buffer de Lisis, teniendo en cuenta las
siguientes concentraciones:
Reactivos

Concentraci

Concentración

ones stock

final

Cantidades
volúmenes

CTAB

----

2%

W = 0.2 g

NaCl

----

1.4 M

W = 0.8 g

EDTA pH 8.0

0.1 M

20 mM

V = 2ml

TRIS-HCl pH 8.0

0.5 M

100 mM

V =2ml

β- Mercaptoetanol

100 %

0.2%

V =0.02ml

----

----

V = 5.98 ml

Aguadestilada

Volumen final

y

10 ml

2. Obtener en el mortero estéril aproximadamente 250 mg de muestra y agregar 5075 µl de T.E. 20:5 y triturar lentamente.

3. Colocar la muestra triturada en un tubo Eppendorf de 1.5 ml y agregar 350 a
500 µl de Buffer de Lisis.

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METODO DE EXTRACCION DE ADN “PROTOCOLO CTAB”

4. Homogenizar suavemente y llevar los tubos a Baño María a 65ºC durante 1
hora, agitar cadacinco minutos.

5. Agregar 350 µl de Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoamilico directamente a la
muestra lisada y agitar vigorosamente durante 10-15 minutos.

6. Centrifugar a 13000 rpm durante 10 minutos.

7. Rescatar el sobrenadante en un nuevo tubo de 1.5 ml

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METODO DE EXTRACCION DE ADN “PROTOCOLO CTAB”

8. Agregar al sobrenadante 400 µl de Isopropanol helado por cada 700 µl de
sobrenadanteobtenido.

9. Observar la formación de una “pelusa” blanquecina en la interfase y luego
mezclar suavemente mediante inversión.

10. Centrifugar a 10000 rpm por 10 minutos.
11. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente y observar la formación de
sedimento o “botón” de ADN.
12. Lavar con 200 µl de Etanol 70% + T.E. y centrifugar a 8000 rpm por 10
minutos.
13. Descartar el sobrenadante y realizar el mismoprocedimiento anterior
utilizando 150µl de Etano 70% + T.E.
14. Descartar el sobrenadante y dejar secar por 10-15 minutos sobre papel toalla.
15. Resuspender el pellet de ADN en 100-150 µl de T.E. 20:5 y verter el contenido
en un tubo de 0.5 ml o “colector” de ADN.

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METODO DE EXTRACCION DE ADN “PROTOCOLO CTAB”

PREGUNTAS
¿Cuáles son las propiedades de los detergentes catiónicos y anionicos?
Lostensoactivos o tensioactivos (también llamados surfactantes) son sustancias que
influyen por medio de la tensión superficial en la superficie de contacto entre dos fases
(p.ej., dos líquidos insolubles uno en otro). El término surfactante es un anglicismo,
tomado de la palabra surfactant, que a su vez es un término que proviene de "Surface
active agent" (agente activo de superficie). Cuando seutilizan en la tecnología doméstica
se denominan como emulsionantes; esto es, sustancias que permiten conseguir o
mantener una emulsión. En función de su mayor o menor dispersión en agua, y su mayor
o menor estabilización de las micelas o coloides, los tensioactivos se emplean como
emulsionantes, humectantes, detergentes o solubilizantes.
Propiedades de los tensioactivos
Las propiedades de los...