Informe Cuantificación de proteínas


Laboratorio Bioquímica
Viernes 7-10


Arley Camilo Patiño



Cuantificación de proteínas: Método de Bradford




Natalia Gómez Toro
Luisa Fernanda Martínez
Santiago Loaiza




Facultad de ciencias Farmacéuticas y alimentarias
Química Farmacéutica
Universidad de Antioquia



10 Julio de 2015

MARCO TEÓRICO

método Bradford
se basa en utilizar un colorante hidrofóbico (comassie blueG-250)cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo que al entrar en contacto con la parte hidrofóbico del interior de una proteína se fija.
Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre.
La determinación del contenido proteico de una muestra requiere la comparación del valorde absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de proteínas, con los que se construye una curva de calibración: a mayor cantidad de proteínas,mayor color desarrollado y por lo tanto, mayor absorbancia, es por ello que se considera un cromóforo exógeno.
Es un método que depende de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y lasproteínas, por lo que es sensible a la presencia de contaminantes tales como los restos de detergentes y líquidos orgánicos, ya que las proteínas pueden perder su estabilidad y perder su forma nativa, lo que provocaría la pérdida de la unión entre el cromóforo y la zona hidrofóbica de las proteínas.
Para determinar la concentración total de proteína se realiza una curva de calibración empleando unaproteína patrón que generalmente es la suero albúmina bovina.


OBJETIVOS

Realizar una curva de calibración de una muestra de solución de albúmina
Determinar la concentración de proteínas en una muestra de suero fetal bovino
Comprender el método de Bradford para la cuantificación de proteínas


DATOS

tubo
concentración (µg/100µL)
absorbancia
1
100
0,975
2
50
0,736
3
25
0,478
4
12,5
0,24
5
6,250,096
6
3,12
0,025
7
1,56
-0,006











RESULTADOS

Curva de calibración




Determinación de concentración muestra problema con absorbancia 0,700

y = 0,0101x - 0,0773











ANÁLISIS DE RESULTADOS

Al leer en el espectrofotómetro se presentaron algunos errores debido a la máquina, el blanco no fue leído correctamente dado que la absorbancia leída de este no era 0 (cero), además la primeradilución leída dio una absorbancia negativa (-0,006) lo cual es incorrecto dado a que una absorbancia no puede tener valores negativos, por esto presentamos algunos errores con los resultados finales de la práctica.
Se puede observar en la curva de calibración que la línea de tendencia está muy lejana a tocar los puntos, esto se debe además de los errores de lectura en el espectrofotómetro, a loserrores cometidos durante la toma de alícuotas, pasarse en la adición del buffer o el manejo poco fluido de la micropipeta.
La concentración de la muestra problema se determinó a partir de la fórmula arrojada por la gráfica, donde se encuentra que esta muestra posee una concentración de 76,96µg/100µL.


PREGUNTAS DE LA GUÍA

1. ¿Cuál es la base del método?
Se basa en la unión de un coloranteComassie Blue a las proteínas a través de grupos ionizados. Interacciona específicamente con aminoácidos básicos aromáticos: fenilalanina, triptófano, prolina y especialmente arginina.


2.¿Cuáles son las interferencias del método?
*Interferencia con detergentes y lípidos
*Interferencia agentes fuertemente alcalinos (fácilmente solucionable con la utilización de buffers)
*Se debe tener en cuentaprevio al trabajo experimental de verificar que los tubos estén limpios debido a que también puede interferir.


3.¿Investigue otros métodos de cuantificación de proteínas ?
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en:
a) La propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV.
b) Para la formación de derivados químicos.
c)...