Informe De Emzimas

DISCUSIÓN LABORATORIO N°4 EXTRACCION Y CARACTERIZACION DE LA FOSFATASA ACIDA DE AORTA DE BOVINO

DISCUSIÓN LABORATORIO N°4 EXTRACCION Y CARACTERIZACION DE LA FOSFATASA ACIDA DE AORTA DE BOVINO

Universidad Iberoamericana de Ciencias y Tecnología
Área Salud 2012

INTEGRANTES: DANIELA ANGULO – CATHERINE ACUÑA - ELIAS ARZOLA – ELIZABETH ALVAREZ – CLAUDIO GARCIA

SECCION: 1ENFERMERIAFECHA: 25 DE ABRIL

PROFESORA(S): CAROLINA LAGOS - VALENTINA MUÑOZ

PARTE I

Efecto en la actividad enzimática de aorta de bovino según pH

Objetivo: determinar el pH óptimo de la enzima fosfatasa ácida de aorta de bovino.

Siguiendo los pasos indicados en la guía de laboratorio y lo que se indica en la tabla 1, Ud. podrá determinar el pH óptimo donde la enzima presenta la mayoractividad enzimática.

Tabla 1. Protocolo para la preparación de soluciones con distintos valores de pH.


Volumen (mL) | Tubo B | Tubo C | Tubo 1 | Tubo 2 | Tubo 3 | Tubo 4 | Tubo 5 |
p-nitrofenilfosfato | - | 1,0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
MgCl2 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
buffer citrato | 0 | 0 | 2.5 (pH 3.0) | 2.5(pH 4.5) | 2.5(pH 5.6) | 2.5(pH 7.5) |2.5(pH 9.0) |
H2O | 4.5 | 4.5 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
Enzima | 1.0 | 0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |

Luego de introducir y mezclar todos los reactivos del cuadro en los diferentes tubos, los tubos de ensayo fueron rotulados con números para que cuando estos fueran incubados a 37°C por 30 min no se produjeran errores.

Después de haber incubado por 30 min los tubosfueron dejados en hielo y finalmente se le incorporo a cada tubo la enzima. Explique el porqué de este paso.

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Luego de la preparación de los distintos tubos con diferentes valores de pH se puede determinar la absorbancia para cada uno de ellos.

Para ello se debe saber que la concentración de producto formado por una enzima se calcula con la fórmula:

C=ABS/ ε L. ε=17500 M-1 cm-1, L= 1 cm.

Obs:

Donde la ε representa el coeficiente de extinción molar y es igual a 17500M-1 cm-1
Y donde L queda representada por la longitud de la cubeta donde se mide ABS en cm, en esta ocasión será igual 1 cm

Y la velocidad de reacción de una enzima se calcula con la fórmula:

Velocidad = [p-nitrifenol] / Δt. DondeΔt es el tiempo de incubación.


Obs:
El [p-nitrofenol] es el producto de la actividad enzimática de la aorta de bovino de tipo fosfatasa.
Tabla 2. Valores de absorbancia, concentración de producto formado y velocidad de reacción de la enzima fosfatasa ácida de bovino.

Tubo | ABSBlanco (b) | ABS muestra | ABS corregida(ABS muestra -ABS blanco) | CONCENTRACIONp-nitrofenol(ABS /ε L) | VELOCIDAD(p-nitrofenol) / Δt |
1 | 0,023 | 0,030 | 0,007 | 4x10-7 | 1,6x10-8 |
2 | 0,023 | 0,350 | 0,327 | 1,86x10-5 | 7,44x10-7 |
3 | 0,023 | 0,466 | 0,443 | 2,53x10-5 | 1,012x10-6 |
4 | 0,023 | 0,321 | 0,298 | 1,70x10-5 | 6,8x10-7 |

Obs 1:

Para encontrar la ABS real de los tubos se debe restar la ABS del tubo blanco. Este tubo fue el único al que no se le añadióenzima, por lo tanto el sustrato no puedo interactuar con esta, sin embargo puede que algunos de los reactivos en el momento de medir la ABS puedan absorber luz, lo que puede interferir en el resultado de los demás tubos si esta no es restada a las demás ABS, ya que no tendremos el valor neto de ABS del producto en los demás tubos a diferentes pH.

Resultados:

ABS tubo blanco - ABS tubo1 = 0,023 - 0,030 = 7x10-3 ABS real del tubo

ABS tubo blanco - ABS tubo 2 = 0,023 - 0,350 = 0,327 ABS real del tubo

ABS tubo blanco - ABS tubo 3 = 0,023 - 0,466 = 0,433 ABS real del tubo

ABS tubo blanco - ABS tubo 4 = 0,023 - 0,321 = 0,298 ABS real del tubo

Obs 2:

Para obtener las diferentes concentraciones de los tubos utilizamos la ecuación de la Ley de...