Informe De Metodos Apestosos De Mierda

INFORME
MÉTODOS INSTRUMENTALES EN BIOQUIMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
Separación de moléculas biológicas: Fraccionamiento y técnicas cromatográficas para azúcares, lípidos y proteínas

1. ¿Cuánta IgG (expresada en mg/mL) se ha separado por mL de suero mediante intercambio iónico?

La técnica que vamos a utilizar (intercambiador aniónico) es un tipo de cromatografía mediante la cual vamos a separarlas igGs de proteínas contaminantes. Para esto es necesario que las proteínas contaminantes tengan una carga neta alta que sea opuesta al intercambio de modo que queden unidas a este.

Dependiendo de su pH la carga a la que se unirá la resina puede ser negativa o positiva ( pH< PI la carga es positiva por lo que se unirá la resina con carga negativa y viceversa)
También los grupos funcionales losencontramos divididos en dos categorías de carga. Los de positiva que serían dietilaminoetilo (DEAE) y de amino cuaternario (Q) ( son utilizados sistemáticamente) y los de carga negativa auto-boymetil (CM), suplometil (S) y sulfopropil (SP).
El intercambio ionizado fuertemente está en un rango amplio de pH. Los débiles parcialmente ionizados en cambio están en un estrecho rango de pH.

Losresultados que hemos obtenido en las prácticas son los siguientes:

Ependorff
Absorbancia
[ ]
1
0,467
0,33357143
2
0,098
0,07
3
0,122
0,08714286
4
0,052
0,03714286
5
0,288
0,20571429
6
0,162
0,11571429
7
0,158
0,11285714
8
0,159
0,11357143
9
0,577
0,41214286
10
0,706
0,50428571
Total
2,789
1,99214286
Total en mg/mL
0,99607143



Expresamos la Absorbancia frente a las fracciones que hemos idorecuperando.

Para calcular la concentración:
Concentración= (Absorbancia/1.4) x Vfracción

Para obtener el resultado que hemos expresando en la tabla ( ver página anterior) hemos realizado la suma total de las concentraciones y la hemos multiplicado por 0.5 ya que la alícuota que se nos entregó en prácticas tenía este volumen. Por lo tanto como podemos observar hemos purificado 0.996 mg de IgGs. Laabsorbancia de la muestra ha ido variando a lo largo de las fracciones. Desde la 4º que solo tiene 0.052 hasta la 10º que es el pico más alto con 0.706

Resultados IgG policlonal (expresada en mg/mL) se ha separado por ml de suero mediante intercambio iónico. Para esto hemos utilizado los ependorff que más absorbancia presentaban lo que quiere decir que tenían mayor concentración de proteína. Al pasarlopor la columna obtenemos los anticuerpos purificados ya que la parte proteica correspondiente a la albumina quedará unida a la columna.
De las fracciones obtenidas solo tenemos en cuenta las siguientes (que corresponden a las primeras que recogimos)

Fracción
Absorbancia
Concentración (mg/mL)
1
0,152
0,108571429
2
0,614
0,438571429
3
0,241
0,172142857

Vamos a aplicar la siguiente formulaSumatorio (VolxConc)x%pureza) = 0.72x0.7= 0.5035 mg/mL de IgG policlonal.


2. ¿Cuánta proteína total hay aproximadamente por mL de plasma, calculada por medio del BCA?
Vamos a realizar una recta patrón que posteriormente utilizaremos para extrapolar nuestros resultados y hallar la concentración de la muestra. Para ello realizaremos diluciones a partir de una solución madre que tendrán concentracionesconocidas, después mediremos la absorbancia y obtendremos la recta patrón.
[ ]
abs
0
0,048
0,2
0,213
0,4
0,354
0,6
0,513
0,8
0,434
1
0,457




Vamos a eliminar el valor 0.8 que se desvía de la recta patrón.
[ ]
abs
0
0,048
0,2
0,213
0,4
0,354
0,8
0,434
1
0,457







Ahora sustituimos en la recta patrón los valores de absorbancia de las muestras problema
y = 0,3859x + 0,116
R² = 0,8789
D-500,568
D-100
0,309
D-200
0,182
D-400
0,119
No vamos a tener en cuenta el valor D-50, procedemos a sustituir con la formula.
Muestra
ABS
[ ]
D-50
0,568
0,3351912
D-100
0,309
0,2352431
D-200
0,182
0,1862338
D-400
0,119
0,1619221
Las concentraciones tal y como esperamos han ido descendiendo (excepto la primera en la cual hemos debido de cometer algún fallo) La recta patrón resulta fiable atendiendo a su...