Informe de organización subcelular

TRABAJO PRÁCTICO N°5:
ORGANIZACIÓN
SUBCELULAR.




Introducción.
La célula dejó de ser un misterio desde que se inventó el microscopio, además éste ha avanzando su
tecnología entregándonos cada vez más información sobre ésta unidad tan importante.
Los científicos usan el Microscopio electrónico de transmisión para observar organelos, ya que éste
tiene la facultad de formar imágenestridimensionales, el problema de éstos es que entregan una
imagen sobre poblada de organelos, dificultando la diferenciación y posible estudio de éstos.
Por eso la importancia del fraccionamiento celular, técnica que separa los componentes de la célula,
en fracciones subcelulares usando técnicas de centrifugación y sedimentación.(1)
La técnica en sí, tomó notoriedad cuando en 1974 Duve junto aClaude y Palade ganaron el premio
Nobel por sus trabajos con fraccionamiento celular para conocer los componentes celulares,
identificando por primera vez organelos separados como los lisosomas.(2)
El fraccionamiento comienza con una buena homogenización, que básicamente es el rompimiento
de la estructura de la célula, esto se puede lograr usando diferentes técnicas, como la lisis de lasenzimas en la pared celular, rompimiento mecánico mediante el uso de moledores, que pueden
moler el tejido congelado o también se puede machacar el tejido con cuchillas como es el caso del
uso de tijeras o máquinas moledoras, también se puede lograr una homogenización por un shock
osmótico o el congelamiento y descongelamiento reiterado de la célula, como vemos existen
muchos métodos para lograruna buena homogenización.
El otro paso es el de filtrar el tejido homogenizado, para eliminar las fracciones de células que no
fueron fraccionadas, esto se puede llevar a cabo gracias a las centrífugas quien separa por densidad
y tamaño, en el fraccionamiento con centrífuga siempre quedarán dos fracciones que
corresponderían al pellet y al sobrenadante, para la separación de partículas quepueden quedar en el
sobrenadante anterior se tiene que usar las ultracentrífugas quienes son mucho más rápidas y logran
ir fraccionando, ya que a menor tamaño del organelo o sustancia mayor es la velocidad que se
necesita para fraccionarlo.(3)
Como se trabaja con componentes ricos en proteínas y otros componentes es de suma importancia
trabajar bajo temperaturas muy estrictas 0ºC-5ºC, ya que laacción de éstas proteínas podrían
generar alteraciones en las fracciones subcelulares, ya que las proteínas del cuerpo trabajan bajo la
temperatura del cuerpo, 37ºC, Por eso se necesita inactivarlas, y así detener su actividad enzimática.
(4)
Una vez listos los fraccionamientos, es necesario identificar a qué organelo corresponde nuestra
fracción, para esto se usan los marcadores, quebásicamente determinará la presencia de actividad
enzimática específica de ciertos organelos. (3)
El fraccionamiento permitió a los científicos estudiar funciones y composición de los organelos
celulares, lo que no se podría haber llevado a cabo utilizando una célula entera sin fraccionar.


Objetivos:
Aplicar de forma correcta el método de fraccionamiento.
Diferenciar componentes celular en lasfracciones subcelulares

Materiales y métodos.
Experimento 1 “Fraccionamiento subcelular”
La actividad se dividirá en dos partes, la primera se basará en la realización de
fraccionamiento como tal de la muestra y la segunda parte se evaluará éste con marcadores
moleculares.
A.1 “Preparación y fraccionamiento de la muestra”
La muestra a usar en el laboratorio será Hígado de pollo, éste setendrá que lavar con una
solución buffer IBc, esto limpiará la muestra de todo rastro sanguíneo que pueda contener.
Después procede a picar trozos pequeños y volver a lavar con la solución buffer. Llevar los
trozos al Ultraturrex, éste hará el trabajo de homogenizar de forma mecánica la muestra,
molerlo hasta que quede completamente homogéneo. Ahora que la muestra está
homogenizada...