informe de transcipcion

Ensayo de PCR multiplex para la detección rápida y genotipificación deHelicobacter pylori Directamente de especímenes de biopsia
ABSTRACTO
Hemos desarrollado y evaluado un nuevo multiplex ensayo simple, PCR para la detección rápida deHelicobacter pylori la infección y para la determinación de vacA y cagA genotipos directamente a partir de muestras de biopsia gástrica. Este ensayo no requiereel cultivo de cepas o la extracción de ADN a partir de muestras de biopsia. Este ensayo de PCR multiplex sería de gran valor sobre todo para los laboratorios de los países en desarrollo.
Hemos desarrollado y evaluado un nuevo multiplex ensayo simple, PCR para la detección rápida deHelicobacter pylori la infección y para la determinación de vacA y cagA genotipos directamente a partir de muestras debiopsia gástrica. Este ensayo no requiere el cultivo de cepas o la extracción de ADN a partir de muestras de biopsia. Este ensayo de PCR multiplex sería de gran valor sobre todo para los laboratorios de los países en desarrollo.
El patógeno gástrico Helicobacter pylori causa gastritis y la úlcera péptica y es un factor de riesgo para el desarrollo temprano de adenocarcinoma gástrico( 15 ). Debido a que es fastidioso y microaerofílico, no puede ser cultivado en muchos laboratorios clínicos o de investigación en los países en desarrollo con escasos recursos. Ninguno de los métodos para detectar H. pylori infección, incluyendo el recientemente desarrollado H. pylori prueba de antígeno de heces ( 4 ) y el análisis de restricción de PCR utilizando un gen de ARN polimerasa ( rpoB ) ( 10 ), puededar una pista sobre los genes de virulencia de H. pyloricepas albergadas por el anfitrión ( 6 , 8 , 9 ). Aunque Park et al. ( 13 ) desarrollaron un método para la obtención de H. pylori genotipo de datos directamente de las muestras de biopsia, que implica la extracción de ADN genómico y requiere varios PCR.
Se presenta el desarrollo de un ensayo de PCR múltiplex por el cual vacA alelos y lapresencia o ausencia de una secuencia señal (S1 y S2) y la región media (M2 M1 y) cagA gen pueden detectarse en una única reacción, directamente de biopsia gástrica muestras dentro de 4 horas después de la endoscopia, sin la necesidad de la cultura o de la extracción de ADN genómico. Esto puede ahorrar tiempo de varias semanas y reactivos costosos (por ejemplo, antibióticos, suero o sangre-y mediosde cultivo suplementados y reactivos para la extracción de ADN) y la instrumentación (por ejemplo, la incubadora de gas doble). La otra H. pylori gen de virulencia multiplex PCR informó anteriormente no estaba estandarizada para las muestras de biopsia, se requiere costosas cuentas Ready-To-Go PCR, y no escribevacA alelos ( 11 ).
Un total de 79 H. pylori cepas aisladas de la India (65 cepas),Japón (6), España (5), Australia (cepa SS1, ratón colonizados), y el Reino Unido y Estados Unidos (cepas 26695 y J99; genomas completamente secuenciados) se utilizaron para desarrollar el ensayo de PCR multiplex. Biopsias frescas (en total, 90) se recogieron al azar de pacientes con úlcera duodenal (41 biopsias), úlcera gástrica (9), dispepsia no ulcerosa (20), duodenitis (6), la gastritis (4), y eladenocarcinoma (7) y de tres voluntarios sanos para una evaluación adicional de este método. Estado infección Cada persona inferirse de PCR múltiple fue ensayada más probando ureasa (RUT) y datos cultura y genotipo obtenidos de biopsia múltiplex PCR se evaluó PCR utilizando ADN extraída cepas cultivadas aisladas de respectivos pacientes descrito anterior ( 5 ). Las secuencias de nucleótidos de loscebadores utilizados se dan en la Tabla Tabla 11 .

TABLA 1.
TABLA 1.
Los cebadores usados ​​para la amplificación de vacA alelos y cagA
Región de ADN (s) amplificada
Primer nombre
Secuencia del cebador
Tamaño (s) Amplicon (pb)
Referencia o fuente
vacA s1 / vacA s2
VAI-F
5'-ATGGAAATACAACAAACACAC-3 '
259/286
2

VAI-R
5'-CTGCTTGAATGCGCCAAAC-3 '


vacA m1 / vacA m2
VAG-F...