Informe DNA Genomico

Identificación de Bacteria Desconocida atraves de la Utilizacion de Extraccion, Amplificacion y Tecnica RFLP de DNA Genomico
Carla Centeno, Nicole Febles, Ronard Herrera, Edgardo Santillana, Ricardo Ortiz, Felipe Pérez, Karina Ruiz, Kevin Santiago,; Departamento de Biología, Universidad de Puerto Rico – Recinto Universitario de Mayagüez; BIOL3770 – 070L









Introducción
El conocimientoclaro de una bacteria es de suma importancia para todas las áreas de la vida humana. Por tal razón, se debe buscar utilizar los métodos más confiables para la identificación, caracterización y clasificación de éstas. El uso del PCR ha ayudado con esto, conduciendo al incremento del conocimiento sobre la gran diversidad de los procariotas (Amaral et al. 2008). Junto a éste, el uso del 16S rARN,altamente especifico en cada organismo, la clasificación de bacterias ha mejorado significativamente (Snel et al. 1999).
En este estudio se utilizó la biología a nivel molecular y no la morfología, tinciones o pruebas bioquímicas ya que con estos métodos puede ser difícil llegar a conclusiones dado a la alta variación en características fenotípicas (Woo et al. 2008). El método utilizado es el máscertero al comparar dos organismos y dirige a conclusiones más claras. El objetivo era determinar si cuatro bacterias, Gram negativas aisladas de un ambiente extremo en Puerto Rico, pertenecían a la misma especie basado en el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Esto es la diferencia en secuencias de ADN homólogos que pueden ser detectadas luego de la digestión delas muestras de ADN por endonucleasas (Botstein et al. 1980).
Para cumplir con el propósito se siguieron tres pasos claves, la extracción del ADN genómico de los microorganismos, la amplificación del gen del 16S rARN y la digestión por endonucleasas de estas secciones amplificadas.
Primero, se prepararon las muestras a utilizar. Se realizó una extracción del ADN genómico de la bacteria. Este esel que contiene todo la información hereditaria de un organismo (Abalaka et al. 2012). Se utilizó el “ADN Purification Kit” de la compañía Promega que se basa en cuatro pasos, lisis celular, precipitación de proteínas, purificación de ADN y rehidratación de éste. Luego, se amplificó el gen del 16S rARN, altamente especifico en todos los organismos, por medio de la Reacción de Polimerasa enCadena (PCR). El “Mastermix”, mezcla proveedora de todo lo necesario para producción de las copias, fue añadido a todas las muestras de la extracción. Con el uso de un termociclador la molécula de ADN fue desnaturalizada y sus hebras separadas con la temperatura 94°C. Para el alineamiento de los cebadores, 24F y 1492R, la temperatura se disminuyó a 54°C. Y por ultimo, para la elongación, latemperatura se elevó a 72°C. Para completar el proceso de preparación de las muestras del análisis, los productos de la amplificación fueron purificados con el “QIAquick PCR Purification Kit” de la compañía Qiagen.
Con las muestras ya listas, se procedió a la digestión de éstas por enzimas de restricción. Estas enzimas son endonucleasas que reconocen regiones palíndromas específicas de nucleótidosy cortan en o cerca de estas (Roberts et al. 1976). La enzima utilizada fue Alu I, aislada del organismo Arthrobacter luteus y reconocedora de la secuencia “AGCT” (Roberts et al. 1985).
Finalmente, para la obtención de pruebas visuales se realizó una electroforesis de gel con los productos de la digestión. Según la literatura y la migración de las bandas, las bacterias serán de la misma especiesolo si presentan la misma cantidad de bandas con igual tamaño.

Materiales y Métodos
Modulo I: Extracción del DNA
Para este Modulo se utilizo el DNA Purification Kit de la compañía Promega. Primero, para poder extraer el DNA de nuestra célula, se realizo una lisis celular. El mismo se logra resuspendiendo las células en 600µl de la solución de lisis Nuclei Lysis Solution. Luego se incubó a...