Informe Ibmc
Páginas: 5 (1071 palabras)
Publicado: 8 de septiembre de 2011
Informe Trabajo Práctico 1
Purificación de ADN plasmídico
Introducción
Objetivo
El objetivo del experimento es la obtención de DNA plasmídico (específicamente, pBluescript de alto numero de copias) proveniente de una colonia de bacterias de Escherichia coli.
Fundamentación del procedimiento
En la primera parte del procedimiento, ya que aun el experimento no estaterminado, nuestra tarea fue aislar el DNA plasmídico de los demás componentes dentro de la bacteria.
En primer lugar se nos entrega la solución 1 integrada por Tris-HCl 50 mM, EDTA 10mM PH 8 y la cepa de E.coli suspendida y en fase estacionaria. Simultáneamente recibimos la solución 2 de lisis alcalina (NaOH 200mM, SDS 1%). El primer paso fue mezclar en proporción ambas soluciones por inversióncon le objetivo de lisar las bacterias debido al alto pH de la solución 2 y a la acción detergente del SDS.
Luego de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente incorporamos en proporción la solución 3 de renaturalizacion(K+AcO- 3M pH 4.8). Esto al tener Ph acido permite la renaturalizacion total de el DNA plasmidico y parcial de otras moléculas.
Con el objetivo de separar el DNAplasmidico del resto de las moléculas sometimos la muestra a centrifugación durante 15 minutos. Como consecuencia obtuvimos un sobrenadante con DNA plasmidico, RNA celular y algunas sales y por otro lado un pellet y una capa superior de residuos. Trasladamos luego el sobrenadante a otro Eppendorf al cual añadimos isopropanol. Al ser éste un alcohol con polaridad menor que el agua disminuye lasolubilidad del soluto, lo que hará mas fácil la precipitación en la próxima centrifugación.
De la misma se obtiene el pellet de DNA plasmidico y RNA y un sobrenadante que se descarta.
Luego, se procede a lavar el pellet resultante con Etanol 70%, alcohol que, debido a su polaridad intermedia permite disolver muchas sales de esta solución sin disolver el DNA y garantizar una mayor pureza en la muestra.Realizamos la última centrifugación, extraemos con una pipeta el exceso de etanol y dejamos secar el pellet dentro del Eppendorf con la tapa abierta.
Para conservarla, ya que en un futuro usaremos la misma muestra para la segunda parte del experimento, se lo disuelve en agua MilliQ. En nuestro caso, esta agua contiene un microlitro de RNasa 10mg/ml, que degradara el ARN completando elaislamiento del DNA plasmídico. Esta ultima solución se guarda a -20º C.
Respuestas al cuestionario
En condiciones normales los plasmidos no son indispensables para la supervivencia del organismo (bacterias y algunos eucariotas) en el cual se encuentran. Sin embargo, en algunos casos pueden cumplir funciones importantes o favorables para la vida de dicho organismo en caso de conferirle a la célulacaracterísticas necesarias para la supervivencia en el determinado medio donde se encuentren.
La incompatibilidad plasmídica es un fenómeno en el cual dos plásmidos, en ausencia de una presión selectiva, se ven imposibilitados de coexistir dentro de una misma célula. Al compartir los mecanismos de replicación, por ejemplo el ORI, comparten a su vez los mecanismos de represión. De esta manera,existe naturalmente una competencia entre ambos plásmidos para permanecer, al cabo de sucesivas generaciones, dentro de la célula, siendo el restante excluido de la misma.
En biología molecular, los plásmidos son frecuentemente utilizados para o bien ser clonados(vectores de clonado), o bien para expresar un gen determinado (vectores de expresión). En el primer caso, son incorporados en losplásmidos secuencias de DNA genómico que se quieren clonar y amplificar. De esta manera, al cultivar esta bacteria en medio solido, se obtendrán colonias provenientes de un único organismo y al multiplicarse el numero de plásmidos, también lo hace el numero de bacterias. En el segundo caso, ademas de colocarse en los plásmidos los insertos de DNA correspondiente, se incorporan secuencias regulatorias...
Purificación de ADN plasmídico
Introducción
Objetivo
El objetivo del experimento es la obtención de DNA plasmídico (específicamente, pBluescript de alto numero de copias) proveniente de una colonia de bacterias de Escherichia coli.
Fundamentación del procedimiento
En la primera parte del procedimiento, ya que aun el experimento no estaterminado, nuestra tarea fue aislar el DNA plasmídico de los demás componentes dentro de la bacteria.
En primer lugar se nos entrega la solución 1 integrada por Tris-HCl 50 mM, EDTA 10mM PH 8 y la cepa de E.coli suspendida y en fase estacionaria. Simultáneamente recibimos la solución 2 de lisis alcalina (NaOH 200mM, SDS 1%). El primer paso fue mezclar en proporción ambas soluciones por inversióncon le objetivo de lisar las bacterias debido al alto pH de la solución 2 y a la acción detergente del SDS.
Luego de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente incorporamos en proporción la solución 3 de renaturalizacion(K+AcO- 3M pH 4.8). Esto al tener Ph acido permite la renaturalizacion total de el DNA plasmidico y parcial de otras moléculas.
Con el objetivo de separar el DNAplasmidico del resto de las moléculas sometimos la muestra a centrifugación durante 15 minutos. Como consecuencia obtuvimos un sobrenadante con DNA plasmidico, RNA celular y algunas sales y por otro lado un pellet y una capa superior de residuos. Trasladamos luego el sobrenadante a otro Eppendorf al cual añadimos isopropanol. Al ser éste un alcohol con polaridad menor que el agua disminuye lasolubilidad del soluto, lo que hará mas fácil la precipitación en la próxima centrifugación.
De la misma se obtiene el pellet de DNA plasmidico y RNA y un sobrenadante que se descarta.
Luego, se procede a lavar el pellet resultante con Etanol 70%, alcohol que, debido a su polaridad intermedia permite disolver muchas sales de esta solución sin disolver el DNA y garantizar una mayor pureza en la muestra.Realizamos la última centrifugación, extraemos con una pipeta el exceso de etanol y dejamos secar el pellet dentro del Eppendorf con la tapa abierta.
Para conservarla, ya que en un futuro usaremos la misma muestra para la segunda parte del experimento, se lo disuelve en agua MilliQ. En nuestro caso, esta agua contiene un microlitro de RNasa 10mg/ml, que degradara el ARN completando elaislamiento del DNA plasmídico. Esta ultima solución se guarda a -20º C.
Respuestas al cuestionario
En condiciones normales los plasmidos no son indispensables para la supervivencia del organismo (bacterias y algunos eucariotas) en el cual se encuentran. Sin embargo, en algunos casos pueden cumplir funciones importantes o favorables para la vida de dicho organismo en caso de conferirle a la célulacaracterísticas necesarias para la supervivencia en el determinado medio donde se encuentren.
La incompatibilidad plasmídica es un fenómeno en el cual dos plásmidos, en ausencia de una presión selectiva, se ven imposibilitados de coexistir dentro de una misma célula. Al compartir los mecanismos de replicación, por ejemplo el ORI, comparten a su vez los mecanismos de represión. De esta manera,existe naturalmente una competencia entre ambos plásmidos para permanecer, al cabo de sucesivas generaciones, dentro de la célula, siendo el restante excluido de la misma.
En biología molecular, los plásmidos son frecuentemente utilizados para o bien ser clonados(vectores de clonado), o bien para expresar un gen determinado (vectores de expresión). En el primer caso, son incorporados en losplásmidos secuencias de DNA genómico que se quieren clonar y amplificar. De esta manera, al cultivar esta bacteria en medio solido, se obtendrán colonias provenientes de un único organismo y al multiplicarse el numero de plásmidos, también lo hace el numero de bacterias. En el segundo caso, ademas de colocarse en los plásmidos los insertos de DNA correspondiente, se incorporan secuencias regulatorias...
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