INFORME LAB TINCION DE GRAM

OBJETIVOS
Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram
Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, al igual de la aplicabilidad clínica de la tinción.
Aprender ocasiones en las que se hace necesario utilizar tinción de Gram en estudios.






















FUNDAMENTO TEÓRICO DE LA TINCIÓN DE GRAM
La tinción de Gram fue creada por Hans Christian Gram a finesdel siglo XIX y puede utilizarse para separar la mayoría de las especies bacterianas en dos grandes grupos, a saber, las que captan el colorante básico, cristal violeta (es decir las bacterias gram positivas), y las que pierden ese colorante por el lavado con el decolorante alcohol o acetona (es decir las bacterias gram negativas).
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre lasparedes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en elpeptidoglucano (también conocido como mureína). Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido ylipopolisacárido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe aque la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, alposeer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.




MATERIALES:
✔Portaobjetos
✔Cubreobjetos
✔Asas de inoculación
✔Mechero Bunsen
✔Pipetas✔Hisopos
✔Colorantes
REACTIVOS:
✔Solución de Cristal Violeta
✔Lugol
✔Safranina
✔Etanol 95%











PROCEDIMIENTO
1. Obtención de la muestra. Fijarla en el portaobjetos.
2. Fijación: se pasa la muestra por el mechero 3 veces.
3. Cubrir la muestra con cristal violeta y dejar actuar durante 1 minuto, posteriormente se lava con agua destilada.
4. Escurrir el colorante y cubrir con lugol (yoduro depotasio). Mantener durante 1 minuto. Luego, lavar con agua.
5. Decolorar con alcohol-acetona durante 35 segundos. Lavar con agua.
6. Cubrir con el colorante de contraste (Fuschia de Gram). Dejar actuar durante 1 minuto. Lavar con agua. Posteriormente, dejar secar la preparación.
7. Observar al microscopio.















RESULTADOS
Observación de la tinción de Gram

Observamos una tinción color violeta,lo que indica hallazgo de bacterias gram positivas.
Una vez teñido el frotis se observa con el objetivo de inmersión (1.000x). Cuando el material orgánico se tiñe con Gram (p. ej., frotis directo) el portaobjetos se evalúa en busca de la presencia de células bacterianas así como de las reacciones Gram (Fig. 3) las morfologías (p. ej., cocos y bacilos) y la disposición (p. ej., cadenas pares,...