Informe Lab1 Completo














INFORME LABORATORIO BIO-267
LABORATORIO N°1 - ESPECTROFOTOMETRIA











Nombres: Camilo Villalobos S. Marco Valencia P.
Profesores: Dra. Ximena Ortega A. Dr. Enrique Vinés V.
Fecha: 07/03/2015.

Introducción

“El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas analíticas que permitan su determinación cualitativa ycuantitativa, así como su caracterización físico-química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopia” [1]. Por definición, la espectrofotometría es una técnica donde se mide la absorción de radiaciones electromagnéticas de las moléculas de un compuesto [1-2], y mediante el valor de absorbancia se puede identificar el compuesto y su concentración.Uno de los fundamentos importantes en los que se basa esta técnica es la Ley de Lambert-Beer. En resumen, esta ley nos dice que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la muestra (a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas) [1-3] e igualmente es proporcional a la distancia que recorre la luz (que es la longitud de las cubetas de medición) y que todoesto depende de un coeficiente de extinción molar o absorbitidad molar “” que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda [3]. Toda esta ley explica el fenómeno de absorbancia (Figura 1).
El instrumento que se usa para realizar toda esta medición de la absorción se denomina Espectrofotómetro. Este instrumento es uno de los principales instrumentos diagnósticos y deinvestigación. Utiliza las propiedades de interacción de la luz para determinar la naturaleza de la sustancia. Este instrumento está compuesto por una fuente luminosa, un portador de muestras, un monocromador, que determina las diferentes longitudes de onda y el sistema detector que determina la absorción de la muestra [5].
Durante desarrollo del práctico y de este informe se llevará a cabo el uso delespectrofotómetro, así como la identificación de concentraciones de muestras desconocidas y absorbancias a distintas longitudes de onda aplicando los fundamentos de la Ley de Lambert-Beer.




Objetivos del práctico


Determinar el espectro de absorción de un compuesto a diferentes concentraciones mediante espectrofotometría.
Uso correcto del espectrofotómetro para conocer las absorbancias de lasdiferentes muestras.
Determinar la concentración de una muestra problema mediante la ecuación de Lambert-Beer.







Reactivos e instrumentos

1. Micropipetas.
2. 2 Caja de puntas.
3. 6 Tubos de ensayo
4. Muestra stock de azul de metileno 1 mg/ml.
5. Muestra problema “A”.
6. Espectrofotómetro.
7. Agua destilada.
8. 3 cubetas de medición.







Desarrollo Experimental y Resultados

I.Obtención de espectro de absorción de azul de metileno.

Se nos entregó una muestra de 0.5ml de azul de metileno de concentración 1 mg/mL, luego mediante los siguientes cálculos determinamos la cantidad de muestra para preparar 2ml de solución 0.005 mg/mL:

Datos:
Volumen 1: “X”
Volumen 2: 2 mL
Concentración 1: 1 mg/mLConcentración 2: 0.005 mg/mL

Luego, después de nuestros cálculos llenamos la cubeta de medición con nuestra solución 0.005 mg/mL y la introducimos al espectrofotómetro previamente calibrado con un blanco (agua destilada) cada vez que se cambió la longitud de onda. Medimos la Absorción a diferentes longitudes de onda: 400nm 450nm, 500nm, 550nm, 600nm, 650nm, 700nm y 750nmobteniendo las siguientes absorciones (Tabla 1):
Tabla 1: Absorción de la muestra a diferentes Longitudes de onda







Con el fin de determinar el punto máximo de absorbancia de manera más específica, seleccionamos la longitud de onda en donde la absorbancia fue mayor, en este caso, en 650nm. Como el rango de longitud era muy amplio, empezamos a medir en rangos cercanos a 650nm, obteniendo los...