Informe Lisozima

METODOLOGÍA Y EXPERIMENTACIÓN BIOQUÍMICA II












4ºLicenciatura BIOQUÍMICA
INTRODUCCION

La lisozima, también llamada muramidasa, es una enzima de 14,4 KDa que daña las células bacterianas catalizando la hidrólisis de las uniones beta 1,4 entre los residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano.
La lisozima es abundante ennumerosas secreciones como la saliva, las lágrimas y el moco entre otros en donde actúa como una barrera frente a las infecciones. Está presente también en los gránulos citoplasmáticos de los neutrófilos polimorfonucleares PMN. Una gran cantidad de esta enzima puede hallarse en las claras de huevo de donde se extrae para su uso industrial, en particular para el control de las bacterias lácticas enlos vinos
La deficiencia en lisozima, debida a mutaciones en el gen LYZ situado en el cromosoma 12, ha sido asociada a displasias esqueléticas y a un aumento de la propensión a las infecciones.
Para aislar y caracterizar la lisozima vamos a explotar sus características las cuales son entre otras: proteínas básicas (pI= 10,5), de bajo peso molecular (14-30KDa), estables a pH acido y presentanactividad lítica frente a paredes bacterianas de Micrococcus kysodeikticus.
La lisozima en nuestro caso se extrajo de la clara de huevo por ser una fuente barata, de fácil acceso y estar en abundante cantidad de modo que el aislamiento va a ser cuantitativamente fácil.

MATERIALES

- Huevo de gallina de cascara marron
- Tampón fosfato pH=6,6 a dos concentraciones diferentes: 0,1M y 0,6M de lacasa comercial Panreac
- Ácido acético 0,1M genérico (preparado en laboratorio BMI)
- Gasas para filtrar
- Columna de penetrabilidad: Sephadex G-75 marca Pharmacia
- Columna de intercambio iónico : Amberlita CG-50 marca Sigma
- Paredes celulares Micrococcus kysodeikticus. Casa sigma
- Reactivo Bradford ( azul de Coomassie) casa Bradford
- Patrón BSA 1mg/mLº
- Geles de PAGE-SDS paraelectroforesis
- Tampón de electroforesis
(T. Tris-HCl 125mM pH: 6,8, glicerol 20% (v/v), SDS 4%(p/v), β-mercaptoetanol 10% (v/v) y azul de bromofenol 0.02% (p/v)).
- Solución de teñido: azul de Coomassie R-250 0,5% (p/v) en MeOh/Ac/H2O 40:10:50 (v/v/v)
- Solución de desteñido: metanol-acético-agua 20:10:70 (v/v/v)
- Patrón de pesos moleculares marca BIO-RAD
- Espectrofotómetro para medidas deabsorbancia , ultrospec® 1100pro, ∆λ =200-900nm

METODOS

Vamos a preparar tampones de fosfato y acido acético que utilizaremos durante todo el procedimiento.
Para la cromatografía de penetrabilidad y preparación del extracto enzimático se prepara un 1L por taquilla de acido acético 0’1M y para la cromatografía de intercambio ionico se preparan por taquilla 0’25L de tampón fosfato 0’1M a pH6’6 y otra de 0’1L de 0’6M a pH 6’6. Tambien se preparan para todos los grupos 0’1L de tampón fosfato a pH 7 que serán empleados en el PAE de E1.

Preparación del extracto enzimático:
El primer paso es separar la clara de la yema de huevo, y posteriormente una serie de pasos para obtener la lisozima de la manera mas pura posible.
Separacion mecánica: El protocolo para aislar la lisozima va apartir del huevo, unos 4 que se reunirán todos en un mismo contenedor para separar la clara de la yema. Medimos el volumen total de clara obtenida que son 36mL.
Tratamiento acido: Aquí cada taquilla coge 16mL y los diluimos un cuarto con acido acético 0’1M para proceder con el tratamiento acido que precipitara todas las proteínas que no sean estables a dicho pH acido. Lo mantenemos 5 minutos deagitación suave y se filtra este volumen con gasas y se centrifuga durante 5’ a 4500 rpm. Al centrifugar quedan en el sedimento proteínas no estables a pH acido y la lisozima y otras proteínas estables en el sobrenadante.
Se recoge el sobrenadante de unos 16mL recuperados a los que nombraremos E1. De aquí separamos 1mL que se conserva en la nevera para su posterior detección de actividad...