Informe Pcr

Ampliación por PCR





Fecha:
07 de Septiembre, 2012.

Introducción
El poder trabajar con el DNA a significado grandes avances en métodos científicos y tecnológicos. La electroforesis es uno método principal para el análisis de ácidos nucleicos y proteínas al final de un largo procedimiento. (1)
El funcionamiento de ésta técnica es en base a laspropiedades eléctricas que posee el ADN para poder realizar una migración en un gel de agarosa. Para controlar el avance de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas son teñidas con un colorante. De otro modo, para controlar la velocidad de la migración, se varía la concentración de agarosa. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera desimples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas. (2)
En Biología Molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo éste procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se ejecuta. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en laelectroforesis de tipo horizontal se trabaja solo con ADN o ARN. (3) En nuestro caso se ha trabajado electroforesis horizontal.
Es importante señalar, que la electroforesis en asociación con otras técnicas tales como PCR e Hibridación, brinda una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a estas técnicas es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de patógenos, detectar cambios o mutaciones anivel génico, visualizar una nueva proteína, entre otros.

El objetivo principal de este práctico es realizar una correcta PCR y posterior electroforesis, esperando que seamos capaces de comprender los procesos que estos métodos implican y que logremos interpretar correctamente un gel de agarosa.

Materiales y Métodos
Para la realización de este práctico utilizamos 6 tubos de 0,2 ml, a loscuales mediante la utilización de una micro-pipeta se deposito una mezcla de MgCl2en distintas cantidades, junto con un templado que tenia 10X PCR Buffer, dNTP´s 10mM, P1 Forward, P2 Reverse, Taq Polimerasa, DNA 25 ng/ml y H2O.
Estos tubos debieron ser llenados con las siguientes cantidades de cada solución:
* Tubo 1: 0 MgCl2 , 1 Templado . - Tubo 2: 0,5 MgCl2 , 1 Templado.
*Tubo 3: 1 MgCl2 , 1 Templado . - Tubo 4: 1,5 MgCl2 , 1 Templado.
* Figura 1
Imagen con los mix
Tubo 5: 2 MgCl2 , 1 Templado . - Tubo 6: 0 MgCl2 , 0 Templado.
Figura 2
Termo- ciclador

Posteriormente al realizar la mezcla los 6 tubos fueron llevados al termo-ciclador, el cual como lo dice su nombre se encarga de exponer estas muestras por 3 procesos y cada unode ellos a distintas temperaturas.

Los procesos del termo-ciclador son separar en solo una hebra el DNA de doble hebra a una temperatura de 98°C, luego la inicialización de los primer que actúan a 54,5°C que tiene como inmerso los nucleótidos para iniciar la síntesis de DNA y para terminar se produce la reacción de la DNA polimerasa a 72°C.
Estos procesos son repetidos unos 40 ciclos, conel objetivo de que se replique el DNA. Mientras se realiza este proceso en la maquina, debemos realizar la preparación del gel de agarosa, para la posterior ejecución de una electroforesis.
Para la preparación del gel necesitamos 1,5 gramos de agarosa, 100 ml de Tag diluido a 1X, 100 ml de Tag a 10X y 900 ml de agua destilada. Una vez realizada la mezclas llevado al microondas por 5 minutosaproximadamente, con el fin de diluir la agarosa, luego agregamos el Tag diluido a la cámara de electroforesis, teniendo mucho cuidado de cubrir casi la mitad el peine que será el encargado,una vez condensado el gel, de dejar el espacio necesario para depositar nuestras mesclas a incubar. Estando condensado el gel y retirado cuidadosamente el peine, se aplica en el primer carril un marcador que...