INFORME proteinas

INFORME T.P.Nº 2: PROTEINAS
1. Obtención de un homogenato y determinación de la concentración de proteínas del mismo.
OBJETIVO:
El objetivo de este trabajo práctico es obtener un homogenato a partir de una muestra de hígado de ratón y determinar la concentración de proteínas en el mismo mediante el método de Bradford.

FUNDAMENTOS:
Para que un proceso sea exitoso es importanteobtener el máximo de pureza con la mínima pérdida de material. El primer paso en la purificación es la ruptura de tejidos o células microbianas a través de un homogeneizador manual para liberar sus proteínas en una solución llamada extracto crudo u homogenato.
A este homogenato le determinamos su concentración de proteínas mediante el método de Bradford, el cual presenta en su composición el coloranteCoomassie blue que se une a la proteína formando un complejo proteína-colorante que absorbe en el uv a 595nm.
Este método se basa en que la unión del colorante Coomassie blue a la proteína produce un corrimiento del máximo de absorbancia de 465nm a 595 nm.
El método de Bradford, es un método indirecto porque no mide la concentración de proteínas sino que mide la absorbancia y en base a eso seobtiene la concentración de proteínas del homogenato. No usamos un método directo porque trabajamos con una mezcla de proteínas y no podemos determinar el valor del coeficiente de extinción molar debido a que cada proteína posee un coeficiente distinto.
La concentración de proteínas de la muestra se obtiene interpolando en una curva de calibración, la cual la realizamos con albumina bovina comoproteína patrón.

MATERIALES Y METODOS:
- Homogeneizador de mano.
- Espectrofotómetro.
- pipeta Pasteur
- centrifuga
-micropipetas, tips y ependorff
- tubos de ensayo


PROCEDIMIENTOS:
- OBTENCION DEL HOMOGENATO:
Procesamos muestras de hígado de ratón obtenidas en dos buffer:
-Buffer TE (Tris-HCl 60 mM –EDTA 1 Mm Ph 6,8): 200 ml
-Buffer de lisis (Tris-HCl 20 mM pH 8 NaCl 137 Mm, NP-40 al 1% (al teneréste detergente, la extracción es más efectiva, ya que solubiliza los lípidos de membrana) y glicerol 10% (para que las proteínas no se desplacen por los pocillos): 200 ml
Tomamos muestras de hígado de ratón lo colocamos en un tubo, agregamos buffer (éste ayuda a romper la muestra y brinda las condiciones necesarias para poder extraerlas), llevamos el tubo a un baño de hielo para proteger a lasproteínas de las desnaturalización y mantener la temperatura de la solución baja. Por medio de un homogeneizador de mano (trabajo mecánico, produce un aumento de la temperatura) se procede a la homogenización de la muestra hasta la desaparición de los restos visibles de tejido. Las muestras se centrifugan por 10 minutos a 10000 rpm a 4ºc para separar lo soluble de lo precipitado. Obteniéndose elpellet (insolubles, son descartados) y sobrenadante (todas las proteínas solubles, lo que denominamos homogenatos)
Luego el homogenato es separado mediante pipeta Pasteur y conservado.

- DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINA EN EL HOMOGENATO POR EL METODO DE BRADFORD:
Utilizamos una mezcla de proteína (50 ul) y un reactivo de Bradford (2,5ul) que contiene un colorante Coomassie blue, seforma un complejo proteína-colorante que absorbe a Abs 595nm. Se empleará este método indirecto para determinar la concentración de proteínas de los homogenatos.
Para ello se procederá a realizar una curva de calibración con albúmina bovina (BSA) como proteína patrón. Las concentraciones de BSA a utilizar son las siguientes: 0,10; 0,25; 0,50; 0,75 y 1,0 mg/ml, y serán obtenidas por diluciones de unstock madre de proteína de 1 mg/ml
Curva de calibración:
[BSA]
0,10
0,25
0,50
0,75
1,0
Vol.BSA
5 μl
12,5 μl
25 μl
37,5 μl
50 μl
Volumen H2O
45 μl
37,5 μl
25 μl
12,5 μl
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Volumen Reactivo Bradford
2,5 ml
2,5 ml
2,5 ml
2,5 ml
2,5 ml
Agitar en vórtex y leer la absorbancia a 595 nm a los 10 minutos. Realizar las determinaciones por triplicado.
Cuantificación de las proteínas de las...