Informe SDS-PAGE


GELES SDS-PAGE Y ELECTROTRANSFERENCIA

OBJETIVOS:

- Comparar los perfiles proteicos obtenidos mediante SDS-PAGE.
- Calcular la movilidad electroforética de diferentes bandas proteicas.

INTRODUCCION:

1- GELES SDS-PAGE:

PROTEINAS: Para la electroforesis en gel de poliacrilamida de muestras proteicas se puede utilizar un sistema de buffers continuo o discontinuo.

Continuo:tiene una clase de gel, el separador (separating) y usa el mismo buffer que el de corrida.
Discontinuo: se coloca arriba del gel separador un gel de mayor poro (stacking) que sirve para concentrar las muestras antes de que entren al gel separador. Cada uno esta compuesto de un buffer que son distintos entre si y a su vez distinto que el de corrida. Esto otorga una mayor resolución.
Lamayoría de las electroforesis analíticas de proteínas se llevan a cabo bajo condiciones que aseguren la disociación de las proteínas en sus subunidades individuales y que minimicen la agregación, para ello se utiliza la combinación de un detergente aniónico como el SDS (dodecilsulfato de sodio) que actúa como agente caotrófico dado que es capaz de interferir en los enlaces no covalentes que mantienen laestructura de una determinada proteína, un agente reductor (-mercaptoetanol o DTT) para romper los enlaces disulfuro tanto inter- como intracatenarios y calor para disociar las proteínas. Los polipéptidos desnaturalizados unidos al SDS obtienen una carga neta (-), las moléculas de detergente se unen a razón de un SDS por cada 2 aminoácidos lo que otorga una carga proporcional a la masa de laproteína.
Entonces el tratamiento conjunto de SDS más el agente reductor eliminan los efectos de las diferentes conformaciones de las proteínas tal que la longitud de la cadena, que refleja la masa, es la única que determina la velocidad de migración. En la siguiente tabla se muestra el rango de linealidad teniendo en cuenta el porcentaje de acrilamida

Rango efectivo de separación en gelesde SDS-PAGE

Acrilamida* (%) Rango lineal de separación (kD)
15,0 12 - 43
10,0 16 - 68
7,5 36 - 94
5,0 57 - 212

* La relación molar entre bisacrilamida y acrilamida es de 1:29

El desplazamiento de las cadenas polipeptídicas es proporcional al logaritmo de la masa, esto nos permite estimar el peso molecular de una proteína comparándola con la distanciade migración de un patrón de proteínas de peso molecular conocido (Markers). Para ello se construye una curva de calibración donde se gráfica los log (PM) vs. el Rf; donde el Rf es la relación entre la distancia de migración de la banda proteica (d) y la longitud de corrida total del gel (I) o sea la distancia desde el borde superior del gel hasta el frente de corrida. Luego se calcula el Rf de laproteína incógnita y se extrapola en la curva el log (PM).

Tinción de proteínas en geles:

Existen diferentes técnicas que permiten la visualización de proteínas resueltas en un gel de poliacrilamida, en general se basan en el reconocimiento específico de los residuos aminoacídicos y cada uno de ellos tiene una sensibilidad distinta. Un inconveniente de estos métodos de visualización es quela tinción es irreversible e interfieren con las técnicas de transferencia. Entre los más utilizados son:

a- Coomasie blue: es el más utilizado; en condiciones ácidas, este colorante se une a los residuos básidos o hidrofóbicos cambiando de marrón a azul intenso. Como cualquier método este colorante detecta mejor algunas proteínas que otras, de esta manera el Coomasie blue es capaz de detectardesde 8-10 nanogramos por banda para algunas proteínas y 25 nanogramos por banda para la mayoría de las proteínas.

b- Tinción con plata: es el método más sensible para detectar proteínas. La técnica involucra la deposición de plata metálica sobre la superficie del gel en donde se localizan las bandas proteicas. Los iones de plata interaccionan y se unen con ciertos grupos funcionales de...