informe tirosinasa

TIROSINASA II: Determinación de la constante Michaelis-Menten y la velocidad máxima

OBJETIVOS
Lo que se buscó con esta práctica fue determinar la actividad enzimática del enzima Tirosinasa variando la concentración del sustrato, el cual fue L-metilDOPA, y también se quiso encontrar el valor de KM para este enzima utilizando el método de curva hiperbólica de Michaelis-Menten y para hallardicho valor se aplicó la ecuación de los inversos o de LineWeare-Burk, la cual es una transformación de la ecuación original de Michaelis-Menten.
RESULTADOS
Después de macerar el banano, filtrarlo y centrifugar el extracto por 5 minutos aproximadamente, la solución sobrenadante que correspondía al enzima se separó del precipitado vertiéndose en un beaker pequeño y este se colocó en un beaker másgrande con un baño de hielo; se procedió a tabular 6 tubos añadiendo diferentes concentraciones de sustrato y la misma concentración de extracto enzimático, a estas soluciones se les midió la absorbancia utilizando un fotocolorímetro, se tomaron los datos correspondientes a cada tubo, como se observa en la siguiente tabla.
t(min)/tubo 1 2 3 4 5 6
Absorbancia
0.5 0.070 0.079 0.085 0.107 0.1530.201
1.0 0.085 0.110 0.121 0.149 0.210 0.276
1.5 0.099 0.141 0.154 0.190 0.264 0.344
2.0 0.111 0.170 0.187 0.225 0.311 0.402
2.5 0.122 0.197 0.217 0.258 0.358 0.453
3.0 0.135 0.222 0.243 0.289 0.396 0.493
3.5 0.145 0.243 0.270 0.316 0.428 0.523
4.0 0.156 0.268 0.294 0.334 0.462 0.545
4.5 0.165 0.288 0.315 0.363 0.485 0.553
5.0 0.177 0.307 0.338 0.386 0.510 0.557
Tabla 1. Absorbanciaregistrada para cada tubo, cada 30 segundos durante 5 minutos.

Posteriormente con los resultados obtenidos se realizaron gráficos de Absorbancia Vs tiempo para encontrar la pendiente de la recta y con esta consideramos la velocidad inicial (Vi) para cada concentración de sustrato.

Las concentraciones de sustrato se obtuvieron aplicando la fórmula general de difusión, son los resultadosobtenidos se llenó la tabla que se presenta a continuación.
Tubo [S]f Vi 1/[S]f 1/ Vi Vi/[S]f
1 0.003 0.0233 333.333 42.92 7.77
2 0.006 0.0506 166.667 19.76 8.43
3 0.009 0.0559 111.111 17.89 6.21
4 0.012 0.061 83.333 16.39 5.08
5 0.015 0.079 66.667 12.66 5.27
6 0.018 0.0794 55.556 12.59 4.41
Tabla 2. Valores hallados para cada uno de los tubos.



Gráfica 1. Corresponde a la ecuación deMichaelis-Menten y muestra el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción catalizada por una enzima.
Las dos gráficas siguientes son transformaciones de la ecuación original de Michaelis-Menten que se supone son más útiles para la expresión de los datos experimentales.


Gráfica 2. Corresponde a la ecuación de Lineweaver-Burk. La pendiente de la recta es KM/Vmáx,y la intersección sobre el eje 1/ν0 es 1/Vmáx; la intersección sobre el eje 1/ [S] es -1/KM.


Gráfica 3. Corresponde a la representación de Eadie- Hofstee. Da los valores de Vmáx y de KM de una forma sencilla.

Los valores de KM y Velocidad máxima hallados de las anteriores gráficas se muestran a continuación (los cálculos se especifican abajo).
Ecuación/ Valores KM V maxMIchaelis-Menten 0.005 0.079
Lineweaver-Burk 0.019 0.17
Eadie-Hofstee -0.010 0.122
Tabla 2. Valores de KM y Velocidad máxima hallados por los diferentes métodos



CALCULOS
Para hallar la concentración sustrato en cada uno delos tubos se utilizó la ecuación de dilución
[S]f =(V1x[S]i)/V2
Donde [S]i es la concentración inicial del sustrato quwe estaba a 0.03 M, V2 es el volumen final de la diluciónque fue 5.0 ml y V1 fue el volumen que se tomó en cada uno de los casos de la solución concentrada y luego se diluyó.
El valor de KM en la ecuación de Michaelis-Menten se halla tomando el punto mas alto de la gráfica como la velocidad máxima, este valor se divide por 2 y se extrapola la concentración de sustrato a este valor de Velocidad.
Para hallar el valor de KM mediante la ecuación de...