Informe

Trabajo Práctico: Espectrofotometría



Alumnos: Arenas Alan
Oronaz Solange
Robbio Juan
Suárez Verónica
3(tres)

Objetivos:
Realizar los siguientes controles al espectrofotómetro : Luz espuria, volumen mínimo , cubetas, centro de banda, linealidad fotométrica, veracidad y precisión
Calcular la concentraciónde proteínas empleando la reacción del Biuret como técnica espectrofotométrica
Obtener los espectros de absorción de azul de metileno, paranitrofenol en solución acuosa y de una mezcla de ambos en partes iguales

Fundamentos

La espectrofotometría es una técnica práctica y precisa de conocer la concentración de una soluciónun analito en solución. Esta consiste en medir el efecto que dichaconcentraciónla cantidad de moleculas presente en la solución tiene sobre la intensidad de un haz de luz luminoso que incide sobre ella.
Si se ilumina una solución con luz monocromática (luz de una sola longitud de onda), ocurrirá que parte de la intensidad de esa luz I0 será absorbida por las moléculas que están en la solución IA,, parte se refleja Ir y parte será transmitida It. Paraque se cumpla el principio de conservación de la energía se cumple
Ecuación 1 

Se define en base a esto transmitancia (T) y absorbancia (A)

Ecuación 2 A+T=1

Ecuación 3

La ley de Lambert-Beer relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se produzca absorción. La relación entreambas intensidades puede expresarse a través de las siguientes relaciones:

Ecuacion 4: T = 

Donde l es la longitud atravesada por la luz en el medio, c es la concentración del absorbente en el medio, a es una constante denominada absortividad, esta depende de cada sustancia y de la longitud de onda con que se trabaje.
La ley explica que hay una relaciónexponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa.
Aplicando logaritmo a ambos miembros de la ley de Lambert-Beer obtenemos otro valor que recibe el nombre de absorbancia (A)

Ecuación 5 : A= log()

Para realizar estas mediciones seutiliza el espectrofotómetro. Al utilizar este equipo se deben realizar ciertos controles para asegurar el buen funcionamiento del mismo. En caso contrario se tendrá que calibrar, tener en cuenta las desviaciones o reparar el equipo. Estos controles son:
Control de luz espuria: la luz espuria es aquella que llega al detector sin haber atravesado la muestra cuya absorbancia se quieredeterminar, esta puede ser de igual o diferente longitud de onda que la longitud seleccionada. La luz espuria se mide en porcentaje de transmitancia y dicho valor debe ser bajo para que no se produzcan desviaciones negativas de la ley de Lambert-Beer, dado que llega al detector más luz de la que debería. De esta forma el porcentaje máximo de luz espuria aceptado es del 1%. Los métodos para detectarlaincluyen filtros o soluciones que son opacos en los rangos en los que se trabaja.
Existe un caso particular de luz espuria que se conoce como luz parásita, esta es la radiación electromagnética de longitud de onda distinta a la seleccionada por el monocromador que llega al detector, que puede pasar o no por la muestra. Como consecuencia hay un aumento de la transmitancia dado que la luzparásita no es absorbida por la solución como lo hace con la nominal. Este fenómeno es más frecuente en los extremos del espectro visible.
Control de centro de banda: indica la correlación entre la longitud de onda leída en el selector y la que realmente llega a la muestra. Si existe diferencia entre la real y la leída en el selector, a esa diferencia se la conoce como corrimiento o desplazamiento...