informe

PRÀCTICA 2: IMMOBILITZACIÓ DE LA - GALACTOSIDASA PEL MÈTODE DE CROSS-LINKING:

1.-Fonament teòric:
La immobilització a partir de la tècnica de cross-linking es caracteritza perquè és un mètode dur que pot induir a canvis importants en la conformació de l’enzim i en conseqüència pèrdua de la seva activitat.
En la pràctica utilitzarem la -galactosidasa de Aspergilus oryzae.S’introduirà una altra variant experimental en el procediment que consistirà en l’addició d’albúmina bovina a la preparació que donarà lloc a una immobilització del tipus co-cross-linking i per tant una preparació força més activa.
2.-Reactius:
- -galactosidasa
- Acetona ( freda)
- Glutaraldehid 50%
- Albúmina bovina
- Tampó acètic-acetat 0,1 M de pH 4,5. Es prepara barrejant 43 ML d’acetat desodi 0,2M amb 50mL de àcid acètic 0,2M, i es porta fins un volum total de 200mL.
- Carbonat de sodi 1M
- ONPG
3.-Procediment experimental:
DIA 1
CROSS-LINKING:
1. En un tub de centrífuga afegim 0,5mL d’una dissolució prèviament preparada de -galactosidasa ( concentració 20mg/ml) amb 1,30mL d’aigua.
2. Un cop preparat el tub, el col·loquem en un bany de gel.
3. A continuació , afegimlentament i realitzant una agitació contínua , 3mL de acetona freda , extreta del congelador.
4. Un cop hem afegit la acetona afegim 0,2 mL de glutaraldehid al 25%.
5. Mantenim la mostra en agitació durant 60 minuts a una temperatura de 30ºC en un agitador orbital.
6. Desprès, centrifuguem 10 min a 5000 r.p.m.
7. Quan han passat els 10 minuts separem el sobrenedat i el residu el suspenem en4mL d’aigua destil·lada i homogeneïtzem la mescla.
8. Centrifuguem un altre cop a les mateixes condicions , i tornem a descartar el sobrenedant.
9. Finalment , duem a terme la preparació “cross-linked” fins a un volum de 10mL amb tampó .
CO-CROSS-LINKING:
1. En un tub de centrífuga , barregem 0,5 Ml d’una dissolució de -galactosidasa ( concentració 20mg/ml) amb 1,1mL d’aigua .
2. Acontinuació , ho col·loquem en un bany de gel.
3. Afegim lentament 200l d’albúmina.
4. Desprès, afegim lentament i amb una agitació continuada , 3mL de acetona freda extreta del congelador.
5. Afegim 0,2mL de glutaraldehid al 25%.
6. Un cop haguem realitzat els passos indicats, realitzarem exactament el mateix procediment que el realitzats al cross-linking.
DIA 2
Determinació de l’activitatenzimàtica:
1. Per a la determinació de l’activitat de la -galactosidasa utilitzem com a substrat el ONPG que el mesclarem amb 100l de la mostra durant 15 minuts , aquest substrat és preparat prèviament per alguns companys. La reacció que dóna lloc és la següent:

2. Com es pot veure en la reacció s’allibera o-nitrofenol com a producte , que podem observar en un espectrofotòmetre a una420nm.
3. Desprès , afegim 0.5 ml de carbonat de sodi que serveixen per a parar la reacció, i ràpidament, agitem i afegim 4 ml d’aigual destil·lada.
4. A continuació, mesurem l’absorció de la mostra 420 nm, utilitzant cubetes d’1cm de pas de llum, en front del blanc que conté la solució d’enzim inactivada.
5. Realitzem una prova control amb l’enzim sense immobilitzar. Per fer-ho preparem 2 ml dedissolució enzimàtica que conté 50 µl de dissolució d’enzim comercial amb tampó acetat .
6. A continuació, prenem 100µl i determinem l’activitat de la mateixa manera que s’ha indicat per l’enzim immobilitzat.
7. L’activitat s’expressa en unitats de lactasa que es defineixen com:


Mostres:
1. Enzim lliure (A. Oryzae)
2. Enzim lliure (A. Oryzae)
3. Enzim cross-linking (A. Oryzae)
4.Enzim cross-linking (A. Oryzae)
5. Enzim co-cross-linking (A. Oryzae) ( 10 mg albúmina)
6. Enzim co-cross-linking (A. Oryzae) ( 10 mg albúmina)
7. Sobrenedant cross-linking (A. Oryzae)
8. Sobrenedant co-cross-linking (A. Oryzae) ( 10 mg albúmina)
9. Primer rentat cross-linking (A. Oryzae)
10. Primer rentat co-cross-linking (A. Oryzae) ( 10 mg albúmina)
Blancs
1. Enzim lliure...