Informe

Identificación del origen de replicación bidireccional de DNA en los cromosomas de mamiferos

Objetivo
Distinguir entre los dos mecanismos de replicación en cromosomas de mamíferos buscando unOBR
Mecanismo de la horquilla de replicación: la síntesis de DNA en la hebra líder es continua, la DNA polimerasa no necesita la DNA primasa para que cree un primer.
Mecanismo de la separación dehebras: las hebras se separan en grandes extensiones y la síntesis se da en muchos sitios. Aparece una mezcla de fragmentos de okazaki y hebras continuas en ambos lados. No hay transición de síntesiscontinua a discontinua en ningún sitio en particular.
Resultados
Los fragmentos de okazaki en cromosomas de mamíferos se originan predominantemente, sino exclusivamente en la hebra retrasada.Estrategia experimental
Sincronización de células en el borde de pasaje de G1/S
Se realizo una depresión con isoleucina que inhibió la activación de las quinasas dependientes de ciclinas las cualesestán encargadas de la regulación del ciclo celular en el pasaje de G1/S.

Se agregó afidil colina para inhibir la DNA polimerasa, todas las células llegan a la fase S pero no pueden comenzar asintetizar el DNA.






Permeabilización de la membrana
Se permeabilizó la membrana con NP40 (detergente no ionico) que genera pequeños huecos en la membrana para permitir la entrada de losdNTP’s marcados con 32P y BrudUTP. Una alternativa a esta técnica es explotar la membrana y utilizar solo los núcleos.




Identificación de fragmentos de okazaki
Experimento PULSE y CHASE
1. Seactiva el ciclo de reproducción de las células y se las expone a α-32P dATP’s por 1,5 minutos. PULSE
¿Cómo se si se están incorporando? Para corroborar, se precipita el DNA con sales, acido TCA adiferentes pH, los dNTP’s no precipitan y mido la precipitancion de α-32P dATP’s que se va con el DNA
2. Se diluye la solución con dNTP’S sin marcar y se precipita con TCA CHASE

Resultados...