Informe
Páginas: 6 (1374 palabras)
Publicado: 6 de octubre de 2012
Introducción
La célula eucariota se caracteriza por poseer su información genética dentro de un núcleo envuelto en una membrana, además de que su organización celular es mucho más compleja que la que se encuentra en células procariontes. Ésta realiza múltiples funciones debido a la existencia de distintos organelos que la componen. Algunos de ellos son los lisosomas que son vesículasmembranosas que poseen enzimas degradativas; las mitocondrias que son las responsables de los procesos de respiración celular y producción de energía; los peroxisomas que degradan ácidos grasos y compuestos tóxicos; el aparato de Golgi que modifica y empaqueta proteínas de secreción; el retículo endoplasmático que sintetiza proteínas de membrana y lípidos; el núcleo que contiene la información genética dela célula; los cloroplastos que se encuentran solo en las células vegetales; entre otros.(A)
El fraccionamiento celular es una técnica desarrollada por Albert Claude y Christian de Duve entre 1940 y 1950 (B). El fin de este método es obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular. Este proceso consta de dos etapas: la primera es la homogeneización, procedimiento querompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin dañar el medio en suspensión, lo cual se logra a través de diversos métodos como la sonicación o shock osmótico, entre otros. La segunda es la centrifugación, en la cual los componentes celulares se separan a través de un campo gravitatorio, los componentes de mayor peso decantan con mayor rapidez y los más pequeños se quedan essuspensión siendo parte del sobrenadante. Al realizar este proceso varias veces aumentando las velocidades de centrifugación, se obtienen distintas fracciones enriquecidas de los distintos componentes celulares, sin embargo la separación no es totalmente pura (1).
Hipótesis
La centrifugación es un método efectivo para separar componentes subcelulares.
Objetivos
- Comprender el proceso defraccionamiento subcelular.
- Conocer e identificar los marcadores moleculares en las fracciones subcelulares.
- Saber utilizar los distintos tipos de tinción según la presencia del organelo que se desee detectar.
Materiales y métodos
Actividad N°1: Fraccionamiento subcelular
A) Fraccionamiento Subcelular del Hígado: Una noche antes de realizar el experimento se dejó en inanición a dosratones adultos. Luego se sacrificaron a estos roedores por dislocación cervical y rápidamente se extrajo el hígado desde la cavidad peritoneal. El hígado extraído se debió dejar en un pequeño vaso con 50 ml de buffer IBc frío. Luego de un tiempo, se picó el órgano con tijeras en pequeños trozos. Se dispuso a sacar la mayor cantidad de sangre del hígado utilizando IBc frío, pasando 4clarificaciones. Se descartó el IBc usado durante picado y se remplazó con 5 ml de IBc frío fresco. Posteriormente se molió el hígado y con el homogenizador, el cual se operó a 1600 RPM, luego se repitió este proceso con un cambio, antes se colocó el recipiente de la mezcla en un recipiente mayor que contenía hielo. Luego se filtró con gasa para separar los trozos grandes de hígado. Con este procedimiento seobtuvo un homogenizado de 45 ml, por lo que se le agregó Ibc hasta obtener 60 ml de solución, lo cual se repartió entre los grupos. Después se colocaron en hielo tres tubos de plástico vacíos, transcurridos dos minutos se sacó uno de ellos para agregarle 4 ml del homogenizado, el cual se centrifugó a 2500 RPM por diez minutos a 4°C. De esto se obtuvo: el primer precipitado (fracción nuclear), elcual fue resuspendido en tres ml de IBc dejándolo en hielo; y el primer sobrenadante, el cual se transfirió a otro de los tubos plásticos, y se centrifugó a 6000 RPM por 20 minuto a 4°C. Finalmente, de esto se obtuvo otro sobrenadante (fracción mitocondrial) que se transfirió al último tubo que quedaba, y se resuspendió el precipitado (fracción mitocondrial) en 3 ml de IBc. Se mantuvo ambos...
La célula eucariota se caracteriza por poseer su información genética dentro de un núcleo envuelto en una membrana, además de que su organización celular es mucho más compleja que la que se encuentra en células procariontes. Ésta realiza múltiples funciones debido a la existencia de distintos organelos que la componen. Algunos de ellos son los lisosomas que son vesículasmembranosas que poseen enzimas degradativas; las mitocondrias que son las responsables de los procesos de respiración celular y producción de energía; los peroxisomas que degradan ácidos grasos y compuestos tóxicos; el aparato de Golgi que modifica y empaqueta proteínas de secreción; el retículo endoplasmático que sintetiza proteínas de membrana y lípidos; el núcleo que contiene la información genética dela célula; los cloroplastos que se encuentran solo en las células vegetales; entre otros.(A)
El fraccionamiento celular es una técnica desarrollada por Albert Claude y Christian de Duve entre 1940 y 1950 (B). El fin de este método es obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular. Este proceso consta de dos etapas: la primera es la homogeneización, procedimiento querompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin dañar el medio en suspensión, lo cual se logra a través de diversos métodos como la sonicación o shock osmótico, entre otros. La segunda es la centrifugación, en la cual los componentes celulares se separan a través de un campo gravitatorio, los componentes de mayor peso decantan con mayor rapidez y los más pequeños se quedan essuspensión siendo parte del sobrenadante. Al realizar este proceso varias veces aumentando las velocidades de centrifugación, se obtienen distintas fracciones enriquecidas de los distintos componentes celulares, sin embargo la separación no es totalmente pura (1).
Hipótesis
La centrifugación es un método efectivo para separar componentes subcelulares.
Objetivos
- Comprender el proceso defraccionamiento subcelular.
- Conocer e identificar los marcadores moleculares en las fracciones subcelulares.
- Saber utilizar los distintos tipos de tinción según la presencia del organelo que se desee detectar.
Materiales y métodos
Actividad N°1: Fraccionamiento subcelular
A) Fraccionamiento Subcelular del Hígado: Una noche antes de realizar el experimento se dejó en inanición a dosratones adultos. Luego se sacrificaron a estos roedores por dislocación cervical y rápidamente se extrajo el hígado desde la cavidad peritoneal. El hígado extraído se debió dejar en un pequeño vaso con 50 ml de buffer IBc frío. Luego de un tiempo, se picó el órgano con tijeras en pequeños trozos. Se dispuso a sacar la mayor cantidad de sangre del hígado utilizando IBc frío, pasando 4clarificaciones. Se descartó el IBc usado durante picado y se remplazó con 5 ml de IBc frío fresco. Posteriormente se molió el hígado y con el homogenizador, el cual se operó a 1600 RPM, luego se repitió este proceso con un cambio, antes se colocó el recipiente de la mezcla en un recipiente mayor que contenía hielo. Luego se filtró con gasa para separar los trozos grandes de hígado. Con este procedimiento seobtuvo un homogenizado de 45 ml, por lo que se le agregó Ibc hasta obtener 60 ml de solución, lo cual se repartió entre los grupos. Después se colocaron en hielo tres tubos de plástico vacíos, transcurridos dos minutos se sacó uno de ellos para agregarle 4 ml del homogenizado, el cual se centrifugó a 2500 RPM por diez minutos a 4°C. De esto se obtuvo: el primer precipitado (fracción nuclear), elcual fue resuspendido en tres ml de IBc dejándolo en hielo; y el primer sobrenadante, el cual se transfirió a otro de los tubos plásticos, y se centrifugó a 6000 RPM por 20 minuto a 4°C. Finalmente, de esto se obtuvo otro sobrenadante (fracción mitocondrial) que se transfirió al último tubo que quedaba, y se resuspendió el precipitado (fracción mitocondrial) en 3 ml de IBc. Se mantuvo ambos...
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