ingenerias de fermentaciones

Metodos de purificación
Basado en las siguientes propiedades proteicas:

Tamaño
Solubilidad
Carga
Adsorción
Afinidad
CAROLINA VITA

Característica

Procedimientos

Tamaño

Dialisis – ultrafiltración
Electroforesis en gel
Cromatografia de exclusión molecular
Ultracentrifufacion

Solubidad

Precipitación con Sales
“
Solventes organicos
‘’
por pH

PolaridadCromatografia de absorción
C. En papel
C. En fase reversa
C. De interaccion hidrofóbica
Cromatografia de intercambio iónico
Electroforesis
Isoelectroenfoque

Carga

Selectividad

Cromatografia de afinidad

Cromatografias de exclusión
molecular
Separan por tamaño
Las columnas rellenas polimeros inertes
Insolubles pero muy hidratados
Sephadex: polimeros de dextrano
Sepharose: agarosaSuperose: agarosa entrecruzada
Sephacryl: dextrano-bisacrilamida
Superdex: agarosa y dextrano

Exclusión molecular
1.La columna se equilibra con el buffer de corrida
2. Aplicación de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna)
3. Elución.

.

Exclusión molecular
1.
2.
3.
4.

Separa mezclas de proteínas por tamaño
De macromoléculas diferente
De grandes estructuras celulares comoribosomas
Determinación de PM

Volumen de exclusión

Proteínas de gran tamaño no penetran
los poros permaneciendo en el
volumen de exclusión de la columna

Vo

Determinacion de PM
Se determina Vo con Blue Dextran
Ve se determina para cada proteína
Vt se calcula de la fórmula π r 2 x h
Kav =Ve-Vo / Vt-Vo
Kav

Log Mw

CARGA
Los grupos R en las proteínas globulares
seencuentran sobre la superficie
exterior de la molécula, aunque también
pueden
tener
grupos
ocultos
o
participando de puentes de H
Carga ⇒ depende de las propiedades
ácido – base de los grupos R

Cromatografía de intercambio iónico
Un intercambiador iónico consiste en una matriz porosa
con grupos cargados unidos covalentemente.
Estos grupos se asocian con iones de la fase móvil(contraiones), estos pueden intercambiarse por otros
iones de las misma carga sin alterar la matriz.
La matriz generalmente es un compuesto inorgánico,
resinas sintéticas o polisacáridos.
Matriz

Nombre

Dextrano

Sephadex

Agarosa

Sepharose CL-6B

Celulosa

Sephacel

Grupos cargados
•

Son una propiedad fundamental del intercambiador.

•

Determina el tipo y la fuerza delintercambiador

• El número total y su disponibilidad determinan la
capacidad del intercambiador

Los de carga negativa adsorben cationes
mientras que los de carga positiva adsorben aniones.
Así se llaman intercambiadores catiónicos y
aniónicos respectivamente.

Cromatografía de intercambio iónico(IEX)
Mecanismo de
separación
•

Separa a moléculas por
carga neta.

•

Grupos cargadosunidos a
la matriz adsorben
muestras de carga
opuesta(reversible)

•

La desorción se logra a
través el cambio del pH o
aumentando la
concentración de sal del
eluyente.

Fig 1.1. las moléculas cargadas se
absorben en los en los
intercambiadores de carga opuesta.
La interacción es un equilibrio
dinámico que puede estar
influenciado por pH como por la
concentración de las sales.Adsorción
Proteínas →poseen aa cargados
en su superficie, se adsorben
sobre el intercambiador

Proteínas con carga neta
negativa se absorben a I.
catiónicos,
La fuerza de adsorción aumenta
con el aumento de carga neta.
La carga de los aa depende del
pH.
la carga neta dependerá del pH
de una manera que es bastante
específica para cada proteína
individual.

Fig 1.2. El tamaño dela fecha
representa la fuerza de la adsorción

Desorción
Existen 2 posibilidades
•Reducir la carga neta
cambiando el pH.
•Agregar un ión que compita
por las cargas del
intercambiador
En IEX se utiliza una sal
monovalente como NaCl, ya
que tiene poco efecto sobre
el pH de la corrida.

Fig 1.3. A mayor carga neta,
mayor es la adsorcion y
mayor la concentracion de
sales que se...