Ingeniería de Proteinas

INGENIERÍA DE PROTEÍNAS

La propiedades funcionales de una proteína derivan de su estructura, que en último termino está determinada por la secuencia nucleotídica del gen que la codifica. El desarrollo de la biología molecular durante los últimos 25 años ha aportado una plétora de procedimientos experimentales y computacionales que permiten analizar y manipular el material genético. Esto hacetécnicamente posible, al menos en teoría, reescribir el texto de una secuencia génica para modificar a voluntad las propiedades de la proteína codificada. La principal limitación para conseguir este objetivo es que la relación entre estructura y función de las proteínas es de una gran complejidad, y en la mayor parte de los casos es imposible saber a priori que alteración estructural seríanecesaria realizar para conseguir determinado cambio de función. En términos operativos, podemos definir la ingeniería de proteínas como la modificación estructural realizada mediante la manipulación del gen codificante, por la cual se consigue un cambio funcional determinado. La máxima expresión de la ingeniería de proteínas es el diseño de proteínas, que consiste en la definición y creación de novo deuna secuencia proteica cuya estructura la haga apta para desempeñar determinada función. La ingeniería de proteínas opera de forma iterativa, siguiendo un proceso cíclico que alterna etapas en las que se planean y ejecutan los cambios a realizar con otras en las que se evalúa el resultado de los mismos. A este proceso se le ha denominado ciclo de diseño

La parte experimental de la ingeniería deproteínas comienza por el aislamiento del gen que codifica la proteína sobre la que queremos actuar e implica la generación de mutaciones en la secuencia del mismo, que se verán traducidas en cambios de la secuencia proteica. En el caso de que se tengan hipótesis razonables sobre que cambios concretos pueden ocasionar el efecto funcional buscado, éstos se introducen mediante mutagénesis dirigida,lo cual da lugar asustituciones definidas de aminoácidos. A esta aproximación metodológica se la suele designar “diseño racional”. En algunos casos, el efecto deseado puede obtenerse combinando dominios o motivos estructurales provenientes de distintas proteínas, para generar una proteína híbrida o quimera. Sin embargo, la situación más frecuente cuando se plantea modificar la función de unaproteína es que no pueda precisarse que tipo de cambio estructural es preciso realizar para obtener el efecto deseado. En estos casos, una estrategia que ha tenido extraordinario auge en los últimos años ha sido la evolución dirigida. Esta aproximación experimental mimetiza a escala de laboratorio el proceso de evolución natural, alternando etapas de mutación génica aleatoria con otras de selecciónfenotípica, aunque en la evolución dirigida el sujeto de la mutagénesis no es un individuo sino un gen concreto, o un conjunto de genes. Este método tiene algunos requerimientos: Por ejemplo, el gen que codifica la proteína que se quiere modificar debe expresarse funcionalmente en un huésped adecuado, normalmente E. coli , S. cerevisiae, u otro microorganismo fácilmente manipulable. Otrorequerimiento es disponer de un procedimiento eficaz para seleccionar, o a menos poder ensayar la función buscada (11). Las técnicas de biología molecular han proporcionado dos herramientas muy eficaces para realizar la mutagénesis aleatoria de genes aislados. Una es la conocida como “error-prone PCR” consistente en la amplificación mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) del gen que codifica laproteína de interés en condiciones que inducen a la DNA-polimerasa a cometer errores (16). El otro procedimiento es el “DNA-shuffling”, que consiste en la fragmentación de la secuencia que se desea mutagenizar mediante digestión con DNAsa, seguida de un reensamblaje de la misma mediante PCR (28). Algunos ensayos funcionales pueden ser considerablemente complejos, a la par que encontrar el mutante...