INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA VEGETAL




INTRODUCCCIÓN
La espectroscopia es una técnica que implica las propiedades de absorbancia de luz en sus distintas longitudes de onda de los analitos, la absorbancia en la región ultravioleta y visible (UV-Vis) del espectro electromagnético, es bastante común en los laboratorios de química y bioquímica, y es utilizada para la identificación cualitativa de algunas sustancias y para lacuantificación de ellas.
Puede ser utilizada para identificar algunos grupos funcionales de moléculas, pero generalmente se utiliza para la determinación cuantitativa de compuestos orgánicos en solución, cada sustancia que se analiza posee un máximo de absorbancia en una longitud de onda específica: que se puede determinar realizando un barrido espectral, donde se observará un máximo de absorbancia enuna determinada longitud de onda, que en efecto es la de trabajo para el analito.
Cuando se tiene el valor de la longitud de onda de trabajo para el analito se puede ajustar una curva de calibración con el fin de obtener la concentración de una muestra problema de la misma naturaleza, este procedimiento se lleva a cabo con muestras estándar de concentración conocida, las cuales se llevan alespectrofotómetro y con la longitud de onda de trabajo del analito se obtiene la absorbancia en distintas concentraciones conocidas, las que al presentar en un gráfico absorbancia vs concentración permiten ajustar una recta en la cual se puede estimar la concentración de una muestra problema a partir de la absorbancia que está presente en la misma longitud de onda.


OBJETIVOS
Preparar soluciones deconcentración conocida, realizar una disolución seriada de concentraciones conocidas.
Realizar un barrido espectral para solución de concentración conocida, y obtener la longitud de onda donde ocurre la mayor absorbancia.
Llevar a cabo los cálculos necesarios para la obtención del coeficiente de extinción molar del analito.
Realizar una curva de calibración del analito, y obtener la concentraciónmolar de una muestra problema.
METODOLOGÍA
ESPECTROGRAMA
-Preparación de la solución:
Se preparó una solución de 50ml, de concentración 1.9x10-3 %m/v, diluyendo desde una solución stock de azul de metileno 3.19x10-2 %m/v. Para lo cual, se tomó con una pipeta un volumen de 3ml desde la solución stock y se trasvasijó en un matraz de 50 ml, luego se llevó la solución hasta el aforo añadiendo aguadestilada.
-Lecturas de Barrido en el espectrofotómetro:
Se realizó un barrido entre 400 y 900 nm efectuando lecturas de absorbancia, en un espectrofotómetro GENESYSTM 10S UV-VIS THERMOSCIENTIFIC, para lo cual se plantó la muestra de azul de metileno y su blanco (agua destilada) en 2 tubos de vidrio de respectivamente (diámetro del tubo 1 cm). Antes de realizar el barrido se encendió elinstrumento y se siguieron los siguientes pasos:
Se seleccionó el modo absorbancia en longitudes de onda.
Se seleccionó el rango en el que se realizó el barrido, entre 400 y 900 nm.
Cada tubo que se introduzca en el instrumento debe ser limpiada con papel tissue.
Se colocó el blanco dentro de la primera celda con el fin de corregir la línea base.
Se colocó la muestra de azul de metileno 1.9x10-3 %m/v enla siguiente celda.
Se inició el barrido.
Se anotó la absorbancia de la muestra cada 12 nanómetros.
Se identificó el máximo de absorbancia y su longitud de onda.
Se calculó el coeficiente de extinción molar del azul de metileno.
Se guardó en un frasco el volumen total de la muestra (50ml) con su respectiva etiqueta (azul de metileno 1.9x10-3 %m/v).
DETERMINACION CUANTITATIVA DE UNA MUESTRAPROBLEMA EN ESPECTROSCOPIA VISIBLE
-Curva de calibración.
Se utilizó el coeficiente de extinción molar que se obtuvo de la experiencia anterior, y se calculó la concentración de 5 soluciones estándar, de tal manera que estas marcaran una absorbancia de 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0.1.
Para esto de realizo una dilución seriada:
Tomando el primer volumen desde el stock utilizando una micropipeta (p1000)...