Ingeniería Genética Cuestionario

PRÁCTICA Nº 1

OBJETIVOS:

1. Determinar la fase exponencial en procariote por método de la cámara de Neubauer.
2. Determinar la fase exponencial en E. coli por el método espectrofotométrico.

DETERMINACIÓN DE LA FASE EXPONENCIAL EN PROCARIOTE


MARCO TEÓRICO


En biotecnología, el conocimiento de las características de crecimiento de un microorganismo es esencial para lograr unaeficiencia de transformación reproducible, y para obtener rendimientos repetibles de plásmidos y proteínas recombinantes. Para conseguir un crecimiento uniforme y equilibrado, el cultivo se recoge en la fase de crecimiento logarítmico o exponencial, donde la tasa de crecimiento y la composición de cada célula en la población es relativamente la misma.
El crecimiento de un microorganismo varía conel medio de cultivo dependiendo del contenido en nutrientes y de la temperatura y de la aireación durante la incubación. Es necesario que la agitación sea vigorosa para mantener la suficiente cantidad de oxígeno disuelto en el medio para soportar el crecimiento. Incluso así, el crecimiento en un medio mínimo comparado con el conseguido en un medio rico manifiesta un alargamiento del periodo deduplicación. Esta diferencia se debe al tiempo y la energía que el microorganismo debe emplear en un medio mínimo para sintetizar los metabolitos que serían proporcionados directamente por un medio rico (complejo). Así, el comienzo y la duración de la fase logarítmica es variable y debe establecerse para cada medio y cada cepa microbiana empleados. La construcción de una curva de crecimiento queincluya las fases de latencia, logarítmica, estacionaria y de muerte nos permitirá establecer estos parámetros.
Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo (en un erlenmeyer en agitación) y se van acumulando productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a detenerse al llegar el cultivo a la fase estacionaria, donde la población se mantieneconstante. Conforme se agota la mayor parte de nutrientes, el número de células que mueren sobrepasa al número de células que se producen y el cultivo entra en fase de muerte.
La gran mayoría de los experimentos comienzan con el inóculo de un pequeño volumen de un medio de crecimiento y después el crecimiento de estas células durante la noche. A la mañana, el crecimiento se habrá detenido y ladensidad celular se encontrará normalmente en torno a las 2-3 x 109 células/ml en medio rico.

Determinación de masa celular por espectrofotometría:

El crecimiento de los cultivos puede seguirse por espectrofotometría. El número de fotones dispersados es proporcional a la masa de células de la muestra. Sin embargo, es la geometría de cada espectrofotómetro la que determina cuanta luz entra en elfotodetector. Por lo tanto, debe construirse para cada espectrofotómetro una curva de calibración que relacione la concentración celular con la absorbancia. Esto se hace midiendo la absorbancia de suspensiones de células de diferente concentración, y determinando la concentración de cada suspensión por recuento microscópico directo.
Es importante señalar que la absorbancia es una medida de masacelular más que de número celular. El tamaño de la célula varía con la fase de crecimiento, de modo que es mejor calibrar el espectrofotómetro con células en crecimiento exponencial porque son tales células las que se emplean en la mayoría de los experimentos. Como regla aproximada para la mayoría de células de E. coli, D.O.600 nm = 1.0 para 8 x 108 células/ml.
Se pueden emplear longitudes deonda distintas a 600 nm para determinar la densidad celular y, de hecho, la sensibilidad aumenta según descienda la longitud de onda. Se pueden emplear longitudes de onda tan bajas como 400 nm, pero no con todos los medios enriquecidos.

Determinación del número de células por el método de conteo en cámara de Neubauer :

El método de elección para la determinación del número total de células de...