Inhibición De La Lactato Deshidrogenasa

Efecto de la concentración de Piruvato y Oxamato en la actividad de la LDH
Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, UNAM, México, D. F., 04510, México.
Efecto de la concentración de Piruvato y Oxamato en la actividad de la LDH
Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, UNAM, México, D. F., 04510, México.

Introducción
LA LDH es una L-lactato; NAD+ oxidoreductasa. Es unaenzima importante el al metabolismo anaerobio de la glucosa para el ATP. Cuando disminuye el O2 celular o bien el pH es cercano a 7, la enzima cataliza la conversión de piruvato a lactato con la concomitante conversión de NADH a NAD+. La velocidad de la reacción se ve disminuida por la interacción de la enzima con un inhibidor tal como el Oxamato, el cual actúa como un inhibidor competitivo. Eloxamato tiene una similitud estructural y química con el piruvato (sustrato de la enzima), por lo que bloquea el sitio activo de la enzima .
Durante el aislamiento y purificación de la LDH es necesario evaluar sus características cinéticas como la actividad enzimática, que involucra el seguimiento de la concentración del sustrato que usa la enzima durante un intervalo de tiempo, piruvato.
El modelode Michaelis-Menten es una de las aproximaciones más simples y conocidas de la cinética enzimática, que relaciona la velocidad de reacción con la concentración de sustrato que con ayuda de la ecuación de Lineweaver- Burk se pueden determinar de manera precisa la Km y la Vmax. Además de poder analizar el tipo de inhibición en la actividad.
La determinación se basa en la detección del cambio deabsorción del NADH que es una molécula que absorbe a 340nm.
Hipótesis
El oxamato actúa como un inhibidor competitivo sobre la LDH debido al gran parecido estructural con el sustrato de la enzima (piruvato), lo cual se evidenciara al aumentar la Km y no verse modificada la Vmax.
Objetivos
*Determinar los parámetros cinéticos de la enzimática, como la actividad específica, Km y Vmax mediante losmodelos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk.
*Analizar y determinar el efecto del oxamato como inhibidor en la actividad catalítica de la LDH
Procedimiento
La medición de la actividad de la LDH se realizó en la reducción del piruvato a lactato en cada una de las fracciones, colocando en cada una 600 μL de amortiguador de fosfatos 100 Mm, 36 μL de piruvato 10 Mm y 291 μL de agua y 63 μLde NADH 4 mM, 10 μL de la fracción correspondiente y se leyó la actividad a 340 nm.
Para cuantificar el efecto de la concentración de piruvato se realizo una dilución 1:500 de la fracción 3 y en celdas se coloco amortiguador de fosfatos, agua, piruvato (variando su concentración) y 63µL de NADH, a esta mezcla se leyó su absorbancia a 340 nm, posteriormente se añadió 10µL de la fracción 3 yadiluida y se determino su actividad a 340nm.
Para cuantificar el efecto del oxamato en la actividad de la LDH se midió la actividad enzimática a diferentes concentraciones de piruvato con 34 µL de oxamato de sodio como inhibidor. La actividad se determino a 340nm cada 15 s; con estos datos se realizaron las curvas temporales con y sin inhibidor graficando Abs en función del Tiempo para poderobtener las pendientes y poder calcular la actividad.
Estos ensayos están basados en la detección del cambio de absorción del NADH y el NAD+. El NADH absorbe a 340 nm, mientras que el NAD+ no absorbe radiación a esta longitud de onda.

Resultados:
Con la pendiente obtenida de la regresión lineal de Absorbancia en función del tiempo de reacción (min) se determino concentración de LDH,cantidad de proteína (mg), actividad enzimática específica (para obtener pureza y rendimiento en cada una de las fracciones) Tabla 1.
Tabla 1. Rendimiento y pureza durante el proceso de purificación de la LDH de musculo de pollo.
Fraccion | Volumen (mL) | Concentración (µg/mL) | Proteina en la fracción (mg) | Actividad enzimatica especifica (mmol min-1 mg-1) | pureza | Rendimiento (%) |
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