INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA UREASA ( E.C. 3.5.1.5) Y DEL SUCCINATO DESHIDROGENASA
Páginas: 12 (2811 palabras)
Publicado: 27 de enero de 2014
PRÁCTICA DE LABORATORIO N° 03
INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA UREASA ( E.C. 3.5.1.5) Y DEL SUCCINATO DESHIDROGENASA (E.C. 1.3.99.1)
I. INTRODUCCIÓN.
En la presente experiencia de práctica investigaremos la inhibición de la actividad enzimática por productos químicos específicos, los llamados Inhibidores. El inhibidor específico usado será bisulfato de sodio y el malonato. Se conoce que elbisulfito se combina con la ureasa inhibiendo la actividad enzimática de modo reversible.
Una molécula inhibidora afecta la actividad enzimática de dos modos: por Inhibición competitiva e inhibición no competitiva. La inhibición competitiva tiene lugar cuando una molécula que es estructuralmente similar al sustrato para una reacción particular, compite por una posición en el sitio activo de laenzima. Esto hace que la enzima no esté disponible al sustrato. La inhibición competitiva puede invertirse si se eleva la concentración del sustrato a niveles suficientemente altos mientras la concentración del inhibidor se mantiene constante.
En la inhibición no competitiva, el inhibidor se une a la enzima en un sitio que no es el sitio activo. Siendo así, cambia la naturaleza de la enzimapara que pierda sus propiedades catalizadoras. Esto sucede de dos maneras. El inhibidor no competitivo bloquea físicamente el acceso al sitio activo, o causa un cambio conformacional en la proteína, inactivándola. Porque las moléculas del sustrato no pueden invertir la posición de un inhibidor no competitivo y aumentar la concentración del sustrato no invertirá la inhibición.
El objetivo de lapresente experiencia es demostrar el efecto inhibidor de algunas sustancias sobre la velocidad de reacción enzimática, utilizando para ello bisulfito de sodio y malonato, como inhibidores de la ureasa y succionato deshidrogenasa, respectivamente.
II. MATERIALES.
Gradillas.
Baño María a 37°C.
Tubos de ensayo 15x 125 mm.
Tubos de ensayo 13 x 100 mm.
Juego de pipetas 10, 5, 2 y 1 ml.Espectrofotómetro.
Fotocolorímetro.
Buffer fosfato de sodio 0.1M pH 7.
2.6 diclorofenolindofenol 0.02%.
Succinato 0.1M.
Malonato 0.1M.
Homogenizado hepático
Buffer Tris 0.05M pH 7.
Úrea 0.1M en buffer Tris 0.05 pH 7.
Bisulfito de Sodio 0.1M.
Ureasa 0.1%.
III. PROCEDIMIENTO.
Prepare el siguiente esquema de tubos y siga las indicaciones que se muestra a continuación:
A. INHIBICIÓN DEUREASA.
1. SISTEMA DE INCUBACIÓN.
COMPONENTES (mL) Y PROCESO
TUBO 1
TUBO 2
TUBO 3
TUBO 4
Buffer Tris 0.05 M PH 7.0
2.0
1.0
----
1.0
Úrea 0.1 M en buffer Tris 0.05 M pH 7.0
2.0
2.0
3.0
2.0
Bisulfito de Sodio 0.1 M
----
1.0
1.0
1.0
Pre Incubar a 37°C por 5 minutos.
Ureasa 0.1%
0.5
0.5
0.5
----
Incubar a 37°C por 15 minutos.
Añadir dos gotas de HgCl2 a cada tubo paradetener la reacción.
Ureasa 0.1%
----
----
-----
0.5
Mezclar, preparar y seguir con el siguiente sistema.
2. Evaluación del efecto inhibidor del bisulfito de sodio: Cuantificación del producto formado por colorimetría (Reacción de Nessler).
Transferir 0.1 mL de cada uno de los tubos de ensayo de la parte 1 a sus correspondientes en la parte 2.
COMPONENTESBLANCO
I
II
III
IV
TUBO 1 (Parte 1)
----
0.1
----
----
----
TUBO 2 (Parte 2)
----
----
0.1
----
----
TUBO 3 (Parte 3)
----
----
----
0.1
----
TUBO 4 (Parte 4)
----
----
----
----
0.1
Agua destilada
4
3.9
3.9
3.9
3.9
Reactivo de Nessler
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Dejar en reposo por 5 minutos. Leer en fotocolorímetro con filtro verde o bien enespectrofotómetro a 540 nn. Restar la lectura del tubo 4 de las lecturas de los otros tubos. Determinar la actividad enzimática en cada uno de los tubos de incubación. Para lo cual deberá multiplicar la lectura de cada tubo por un factor:
FR = 37 mg NH3 / ml, para espectrofotómetro
y 0.006 mg NH3 / ml, para fotocolorímetro.
B. INHIBICIÓN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA.
1. SISTEMAS DE INCUBACIÓN Y...
INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA UREASA ( E.C. 3.5.1.5) Y DEL SUCCINATO DESHIDROGENASA (E.C. 1.3.99.1)
I. INTRODUCCIÓN.
En la presente experiencia de práctica investigaremos la inhibición de la actividad enzimática por productos químicos específicos, los llamados Inhibidores. El inhibidor específico usado será bisulfato de sodio y el malonato. Se conoce que elbisulfito se combina con la ureasa inhibiendo la actividad enzimática de modo reversible.
Una molécula inhibidora afecta la actividad enzimática de dos modos: por Inhibición competitiva e inhibición no competitiva. La inhibición competitiva tiene lugar cuando una molécula que es estructuralmente similar al sustrato para una reacción particular, compite por una posición en el sitio activo de laenzima. Esto hace que la enzima no esté disponible al sustrato. La inhibición competitiva puede invertirse si se eleva la concentración del sustrato a niveles suficientemente altos mientras la concentración del inhibidor se mantiene constante.
En la inhibición no competitiva, el inhibidor se une a la enzima en un sitio que no es el sitio activo. Siendo así, cambia la naturaleza de la enzimapara que pierda sus propiedades catalizadoras. Esto sucede de dos maneras. El inhibidor no competitivo bloquea físicamente el acceso al sitio activo, o causa un cambio conformacional en la proteína, inactivándola. Porque las moléculas del sustrato no pueden invertir la posición de un inhibidor no competitivo y aumentar la concentración del sustrato no invertirá la inhibición.
El objetivo de lapresente experiencia es demostrar el efecto inhibidor de algunas sustancias sobre la velocidad de reacción enzimática, utilizando para ello bisulfito de sodio y malonato, como inhibidores de la ureasa y succionato deshidrogenasa, respectivamente.
II. MATERIALES.
Gradillas.
Baño María a 37°C.
Tubos de ensayo 15x 125 mm.
Tubos de ensayo 13 x 100 mm.
Juego de pipetas 10, 5, 2 y 1 ml.Espectrofotómetro.
Fotocolorímetro.
Buffer fosfato de sodio 0.1M pH 7.
2.6 diclorofenolindofenol 0.02%.
Succinato 0.1M.
Malonato 0.1M.
Homogenizado hepático
Buffer Tris 0.05M pH 7.
Úrea 0.1M en buffer Tris 0.05 pH 7.
Bisulfito de Sodio 0.1M.
Ureasa 0.1%.
III. PROCEDIMIENTO.
Prepare el siguiente esquema de tubos y siga las indicaciones que se muestra a continuación:
A. INHIBICIÓN DEUREASA.
1. SISTEMA DE INCUBACIÓN.
COMPONENTES (mL) Y PROCESO
TUBO 1
TUBO 2
TUBO 3
TUBO 4
Buffer Tris 0.05 M PH 7.0
2.0
1.0
----
1.0
Úrea 0.1 M en buffer Tris 0.05 M pH 7.0
2.0
2.0
3.0
2.0
Bisulfito de Sodio 0.1 M
----
1.0
1.0
1.0
Pre Incubar a 37°C por 5 minutos.
Ureasa 0.1%
0.5
0.5
0.5
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Incubar a 37°C por 15 minutos.
Añadir dos gotas de HgCl2 a cada tubo paradetener la reacción.
Ureasa 0.1%
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0.5
Mezclar, preparar y seguir con el siguiente sistema.
2. Evaluación del efecto inhibidor del bisulfito de sodio: Cuantificación del producto formado por colorimetría (Reacción de Nessler).
Transferir 0.1 mL de cada uno de los tubos de ensayo de la parte 1 a sus correspondientes en la parte 2.
COMPONENTESBLANCO
I
II
III
IV
TUBO 1 (Parte 1)
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0.1
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TUBO 2 (Parte 2)
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0.1
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TUBO 3 (Parte 3)
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0.1
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TUBO 4 (Parte 4)
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0.1
Agua destilada
4
3.9
3.9
3.9
3.9
Reactivo de Nessler
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Dejar en reposo por 5 minutos. Leer en fotocolorímetro con filtro verde o bien enespectrofotómetro a 540 nn. Restar la lectura del tubo 4 de las lecturas de los otros tubos. Determinar la actividad enzimática en cada uno de los tubos de incubación. Para lo cual deberá multiplicar la lectura de cada tubo por un factor:
FR = 37 mg NH3 / ml, para espectrofotómetro
y 0.006 mg NH3 / ml, para fotocolorímetro.
B. INHIBICIÓN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA.
1. SISTEMAS DE INCUBACIÓN Y...
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