inmunodifusion radial







Laboratorio Nº4
“INMUNODIFUSION RADIAL”











Introducción
La inmunodifusión radial (IDR) es una técnica que puede determinar cuantitativamente la concentración de un antígeno. Es una técnica sensible que es usada clínicamente para detectar niveles de proteínas plasmáticas.
Principio: Un anticuerpo es incorporado en agarosa fundida, la cuales vertida dentro de una caja de Petri la cual se deja solidificar. Se cortan pequeños pozos dentro de la agarosa y estos son llenados con concentraciones conocidas de antígeno correspondientes al anticuerpo, con el objeto de construir una curva de calibración. Las muestras desconocidas se colocan dentro de los pozos.
Los antígenos en solución difundirán hacia fuera del pozo en un patróncircular rodeando al pozo. El anticuerpo está presente en exceso y la difusión del antígeno continuará hasta que se forme un precipitado antígeno-anticuerpo en forma de anillo estable. Habrá complejo Ag-Ac en toda la zona circundante al pozo dentro de la línea de precipitación. En esta línea es donde está presente el mayor número de complejos, ya que en ese punto el antígeno y el anticuerpo están enproporciones iguales. Esta es conocida como la zona de equivalencia.
Generalmente toma de 48 a 72 horas para que ocurra la difusión óptima y la precipitación se haga evidente. Para cada antígeno, se formará una precipitación final en anillo de cierto diámetro. De las concentraciones conocidas estándar, se traza una curva de calibración, colocando en los ejes: concentración de antígeno v/smediciones de diámetro cuadrado de los anillos. A partir de esta curva de calibración lineal, la presencia y cantidad de antígeno en las muestras desconocidas pueden ser determinadas.




Objetivos

Cuantificar las inmunoglobulinas (IGG, IGA, IGM) y Complemento (C3 y C4) mediante la técnica de inmunodifusión radial.

Identificar los requerimientos técnicos que debemos considerar al realizar estatécnica.

Materiales e insumos

Placas IDR anti-IGG
Placas IDR anti-IGM
Placas IDR anti-IGA
Placas IDR anti-complemento C3
Placas IDR anti-complemento C4
Micropipeta de 10uL-100uL
Micropipeta de 1 a 10 uL
Puntas desechables amarillas 10 a 100 uL
Puntas desechables blancas 1 a 10 uL
Tubos de Khan 75x13 mm
Guantes
lupa
Muestras:
Sueros problemas

Equipos:
Cámara de incubaciónRefrigerador
Vortex










Procedimiento
Abrir la placa (el agar contiene Ag o Ac) para permitir que se evapore el exceso de humedad, si lo hubiera.
Sembrar las muestras problemas para determinar los niveles de IGG, IGA, IGM, C3, C4 en sus respectivas placas.
Sembrar en orificio de la placa: 5 uL de controles y cada una de las muestras problema utilizando micropipeta deprecisión.
NOTA: debe tenerse suma precaución al sembrar, evitando derramar muestra fuera del pocillo, romper los bordes del mismo o introducir burbujas de aire.
Registre en su hoja de trabajo la posición en que sembró
Colocar Algodón o papel filtro humedecido en el centro de la placa, para mantener la humedad del agar.
Cerrar firmemente la tapa
Incubar en posición invertida en cámara húmeda (eneste caso refrigerador) por 16-20 hrs.

Lectura de resultado:

Al día siguiente DEBEN MEDIR LOS DIAMETROS DEL HALO DE DIFUSIÓN con una precisión 1 mm,
El punto final de la reacción está indicado por la aparición de un anillo de bordes netos.
El mismo se alcanza una vez cumplido el tiempo de incubación.
A partir de ese momento puede efectuarse la lectura, ya que el halo no aumentará detamaño.
Interpolar la concentración en la tabla que se adjunta en el inserto de las placas de IDR.

Control de calidad
Debe tenerse suma precaución al sembrar, evitando derramar muestra fuera del pocillo, romper los bordes del mismo o introducir burbujas de air. En caso de que esto ocurra, sembrar un nuevo pocillo.
Si una vez abierta la placa se observan signos de deshidratación o deterioro...